Роль порушень метаболічних та імунних процесів у патогенезі формування експериментального алергічного альвеоліту і іммобілізаційного стресу та їх фармакологічна корекція

АНОТАЦІЯ

Галій-Луцька В.В. «Роль порушень метаболічних та імунних процесів у патогенезі формування експериментального алергічного альвеоліту і іммобілізаційного стресу та їх фармакологічна корекція». — Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії за спеціальністю 222 – Медицина (22 - Охорона здоров’я). – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, Львів, 2024. Дисертаційна робота присвячена визначенню зрушень імунної, прооксидантно-антиоксидантної і системи оксиду азоту при експериментальному алергічному альвеоліті (ЕАА) в умовах іммобілізаційного стресу (ІС), встановленню ефективності корекції корвітином і тіотриазоліном. Було використано 118 самців морських свинок, що знаходились у віварії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького у типовій обстановці, масою фіксованою в межах 180-210 г,. Відповідно до мети дослідження, використано п’ять груп піддослідних тварин: перша (контроль) – інтактні тварини (10); друга група – морські свинки з ЕАА, складалася з трьох підгруп, декапітованих на 1-у, 14-у і 24-у доби (30); третя група – тварини з ІС, що налічувала три підгрупи, декапітовані у вищезазначені терміни (30); четверта група – морські свинки з ЕАА та ІС, що нараховувала три підгрупи, кожну з яких було декапітовано у вказані раніше доби (30); п’ята група — піддослідні тварини з ЕАА та ІС (18), декапітовані на 24-у добу після лікування, що включала дві підгрупи: в одній щодня впродовж 11 днів (з 14-ї по 24-у доби) внутрішньом'язово застосовували у дозі 50 мг/кг тіотриазолін (виробництва ПАТ «Галичфарм») і внутрішньоочеревинно корвітин у дозі 40 мг/кг (виробництво «Борщагівський хіміко - фармацевтичний завод»), у другій — лише корвітин у відповідній дозі і термінах. Обрано закріплені доби виведення з експерименту згідно стадіям стресу: 1 доба – стадія тривоги (до 4 діб); 14 доба – резистентності (5-14 доби); 24 доба – стадія виснаження (з 15 доби розвитку стресу). Проведено моделювання ЕАА шляхом ін’єкції повного ад'юванта Фрейнда і БЦЖ тваринам на 1-у, 14-у і 24-у доби. Для виведення з експерименту після підготовчого введення налбуфіну гідрохлориду (ТОВ «Юрія-Фарм», Україна) в дозуванні 182 мг/кг внутрішньоочеревинно у 1, 14, 24-у доби постановки моделі ЕАА і ІС, було виконано декапітацію, з подальшим забором крові і легень для здійснення експериментів, описаних нижче. Гіперсенситивний пневмоніт (експериментальний алергічний альвеоліт (ЕАА)) відтворено методом О.О. Орехова, Ю.А. Кирилова, а стрес, зумовлений знерухомленням (іммобілізаційний стрес (ІС)), — методом П.Д. Горизонтова. Експериментальний гіперчутливий пневмоніт (1-а, 14-а, 24-а доби) відносно відповідних параметрів крові інтактних тварин супроводжується неухильним зниженням Т-лімфоцитів відповідно на 33,4%, 36,2%, 39,6% (P<0,05), збільшенням В-лімфоцитів на 27,8%, 31,1%, 44,3% (P<0,05), циркулюючих імунних комплексів — на 41,1%, 46,6%, 50,7% (P<0,05), що є проявом індукування гуморального імунітету і послаблення клітинного. Введення тіотриазоліну і корвітину в 24-у добу експерименту порівняно зі значеннями групи тварин з експериментальною постановкою гіперсенсиивного пневмоніту і стресу, викликаного знерухомленням, де не було застосовано медичних препаратів, стало причиною підвищення Т-лімфоцитів на 40,0% (P<0,05), зменшення В-лімфоцитів на 24,3% (P<0,05) і ЦІК на 26,0% (P<0,05), що вказує на їх імуномодулюючий характер дії. Розвиток експериментального гіперсенситивного пневмоніту і стресу, обумовленого іммобілізацією (1-а, 14-а, 24-а доби), порівняно з контрольною групою, призводив до значного підвищення фактора некрозу пухлин альфа (TNF-α) крові – відповідно на 57,8%, 63,1%, 78,9% (P<0,05), інтерлейкіну-6 (IL-6) — на 37,9%, 43,1%, 58,6% (P<0,05), зниження інтерлейкіну-10 (IL-10) на 33,3%, 36,6%, 43,3% (P<0,05), що засвідчує про першорядне значення незбалансованості цитокінового профілю в патогенезі ЕАА і ІС. Введення тіотриазоліну спільно з корвітином, відносно групи тварин з експериментальним моделюванням гіперчутливого пневмоніту і ІС на 24-у добу експерименту без введення вищевказаних медичних засобів, спричиняло спадання ФНП-α на 35,2%, IL-6 — на 33,7%, підвищення IL-10 на 47,0% (P<0,05) крові, що вказувало на їх цитокінокоригуючий вплив. Прогресування (1-а, 14-а, 24-а доби) змодельованого гіперсенситивного пневмоніту зі стресом, викликаним іммобілізацією, відносно групи контролю влегенях спричиняє зростанням вмісту стабільних метаболітів NO (нітрит-нітрат іонів) відповідно на 75,0%, 125,0%, 140,0% (P<0,05), сумарної активності NOS (NO-синтаз) на 72,2%, 111,1%, 122,2% (P<0,05) та зниження L-аргініну на
31,6%, 50,0% 55,0% (P<0,05). Введення тіотриазоліну і корвітину на 24-у добу експериментальної постановки гіперчутливого пневмоніту і ІС, порівняно з групою тварин без впливу лікарських засобів, вело до зменшення в легенях стабільних метаболітів оксиду азоту на 37,5% (P<0,05), сумарної активності NOS – на 35,0% (P<0,05) підвищення L-аргініну на 55,5% (P<0,05), що підтверджує їх корекційну здатність щодо зазначених метаболічних розладів. Експериментальний гіперсенситивний пневмоніт з ІС (1-а, 14-а, 24-а доби) викликає в легенях суттєві відхилення характеру вільнорадикальних реакцій проти відповідних параметрів інтактних тварин: зростання дієнових кон’югатів (ДК) відповідно на 64,8%, 80,0%, 90,4% (P<0,05), малонового діальдегіду (МДА) на 68,7%, 74,8%, 88,6% (P<0,05), зниження супероксиддисмутази (СОД) — на 27,8%, 34,7%, 44,1% (P<0,05), каталази (КТ) на 48,5%, 52,1%, 55,1% (P<0,05), церулоплазміну (ЦП) на 31,5%, 40,8%, 44,3% (P<0,05) як властива ознака оксидантного стресу. Порівняно зі значеннями групи тварин, що не підлягали дії досліджуваних лікарських середників, на 24-у добу експерименту в легенях було помічено зниження ДК і МДА на 29,8% і 16,1% (P<0,05), зростання ЦП,КТ, СОД, на 50,3%, 80,4%, 45,0% (P<0,05) відповідно, що демонструє антиоксидантний ефект поєднання даних медичних препаратів. Наукова новизна отриманих результатів. Вперше виявлено притаманні для прогресування експериментального гіперчутливого пневмоніту і стресу, спричиненого іммобілізацією, відхилення у крові і легенях цитокінового статусу, імунних процесів, інтенсивності вільнорадикального окиснення ліпідів, функціонування систем антиоксидантного захисту та оксиду азоту, встановлено роль вказаних змін в патогенезі зазначених патологій.
Вперше продемонстровано властиві ознаки імунних відхилень — депресія клітинного і індукування гуморального імунітету, домінуючого на 24- у добу моделювання гіперсенситивного пневмоніту з іммобілізаційним стресом. Вперше розкрито тенденцію, переважаючу на 14-у і 24-у доби експериментального гіперчутливого пневмоніту і стресу, викликаним іммобілізацією, до зростання прозапальних цитокінів, зниження IL-10.
Уперше охарактеризовано при моделюванні гіперчутливого пневмоніту зі стресом, зумовленим знерухомленням, інгібування функціонування антиоксидантних захисних механізмів з інтенсифікацією прооксидантних, більш помітне на 14-у і 24-у доби. Уперше розкрито, що в динаміці формування алергічного альвеоліту і іммобілізаційного стресу відбувається зростання вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту, сумарної активності NO синтаз в легенях, переважаючи на 24-у добу експерименту, а також зниження концентрації L-аргініну. Уперше доведено антиоксидантний, імуномодулюючий і цитокінокоригуючий вплив тіотриазоліну і корвітину при експериментальному моделюванні алергічного альвеоліту в умовах іммобілізаційного стресу. Практичне значення отриманих результатів. Результати виконаних досліджень дають можливість більш докладно сформувати розуміння патогенезу експериментального алергічного альвеоліту і іммобілізаційного стресу, і можуть використовуватись в дослідницькій діяльності та практичній медицині. Доведена антиоксидантна та імунокоригуюча дія тіотриазоліну і корвітину вказує на перспективність і доцільність їх подальшого вивчення в експерименті та клініці (пульмонології, алергології, неврології, психіатрії) з метою корекції порушень метаболічних та імунних процесів при експериментальному алергічному альвеоліті і іммобілізаційному стресі та розробки методичних вказівок.
Результати досліджень було застосовано в ході навчання на кафедрі патологічної фізіології Тернопільського національного медичного університету імені І. Я. Горбачевського, Івано-Франківського національного медичного університету, ВДНЗ України “Буковинський державний медичний університет”, кафедрах патофізіології, фізіології та анатомії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, що засвідчено актами впровадження.
Ключові слова: іммобілізаційний стрес, експериментальний алергічний альвеоліт, гомогенат легеневої тканини, кров, лімфоцити, цитокіни, система оксиду азоту, перекисне окиснення ліпідів, антиоксидантна система, тіотриазолін, корвітин.

SUMMARY

Galii-Lutska V.V. "The role of disorders of metabolic and immune processes in the pathogenesis of the formation of experimental allergic alveolitis and immobilization stress and their pharmacological correction." - Qualifying scientific work on manuscript rights. Dissertation for the degree of Doctor of Philosophy in specialty 222 - Medicine (22 - Health Care). - Lviv National Medical University named after Danylo Halytskyi, Ministry of Health of Ukraine, Lviv, 2024.
The dissertation is devoted to determining the nature of changes in some indicators of the immune, pro-oxidant-antioxidant and nitric oxide systems during experimental reproduction of allergic alveolitis and during simulation of immobilization stress both in isolation and in the conditions of their combination, as well as identifying the effectiveness of the combination of corvitin and thiotriazoline in terms of possible correction of values studied parameters. 118 male guinea pigs weighing 180-210 g were included in the study. The experimental animals were kept under standard conditions in the vivarium of the Danylo Halytsky Lviv National Medical University.
According to the research objective of the dissertation work, guinea pigs were divided into five groups: the first group – (control) intact animals (10); the second group – guinea pigs with EAA, which consisted of three subgroups: respectively on the 1st, 14th and 24th days of the experiment before treatment (30); the third group - animals with IS, which consisted of three subgroups: respectively on the 1st, 14th and 24th days of the experiment before treatment (30); the fourth group - guinea pigs with EAA and IS, which consisted of three subgroups on the 1st, 14th and 24th days of the experiment before treatment (30); the fifth group - guinea pigs with EAA and IS (18) on the 24th day of the experiment after treatment and contained two subgroups. In the first, thiotriazoline was used (manufactured by PJSC "Halychpharm") was used, which was administered intramuscularly at a dose of 50 mg/kg daily and in combination with corvitin (produced by "Borshchagivsky Chemiko - Pharmaceutical Plant") at a dose of 40 mg/kg intraperitoneally for 11 days (with 14th to 24th days) and in the second, only corvitin was used in a similar dose and terms. Fixed days were chosen for conducting the experiment and decapitation, which corresponded to the stages of stress development: 1 day – the stage of anxiety, which lasts up to 4 days; 14 days – resistance that develops from 5 to 14 days; The 24th day is the exhaustion stage that occurs from the 15th day of stress formation and the formation of EAA by immunization (administration of complete Freund's adjuvant and BCG) of animals on the 1st, 14th and 24th days. To remove the animals from the experiment, the decapitation method was used after the previous intraperitoneal administration of nalbuphine hydrochloride (Yuria-Pharm LLC, Ukraine) in a dosage of 182 mg/kg. Intact guinea pigs and animals on the 1st, 14th, and 24th days of EAA and IS development were decapitated under nalbuphine anesthesia, and blood and lungs were collected for biochemical, immunological, and immunoenzymatic studies. Allergic alveolitis was modeled according to the method of O.O. Orekhova, Yu.A. Kyrylov, and the immobilization stress was reproduced according to the method of P.D. Gorizontova, O.I. Belousova, M.I. Fedotova. Experimental allergic alveolitis (EAA) combined with immobilization stress (IS) (1st, 14th, 24th days) is accompanied by a significant sequential decrease in the content of T-lymphocytes by 33.4%, 36.2%, 39.6%, respectively % (P<0.05) and an increase in the level of B-lymphocytes by 27.8%, 31.1%, 44.3% (P<0.05) and circulating immune complexes in the blood by 41.1%, 46, 6%, 50.7% (P<0.05) against the control group of animals, which indicated the stimulation of humoral against the suppression of cellular immunity and their leading place in the pathogenesis of the development of alveolitis and stress.
The combined use of thiotriazoline and corvitin led to an increase in the level of T-lymphocytes by 40.0% (P<0.05) and a decrease in the level of B-lymphocytes by24.3% (P<0.05) and CIC by 26.0% ( P<0.05) relative to the group of animals on the 24th day of the experiment without the influence of these drugs in allergic alveolitis and stress, which indicated their immunomodulatory effect. The development of experimental allergic alveolitis and immobilization stress (1st, 14th, 24th days) causes a significant increase in the content of tumor necrosis factor (TNF-α) - alpha by 57.8%, 63.1%, 78.9%, respectively % (P<0.05), interleukin-6 (IL-6) in the blood by 37.9%, 43.1%, 58.6% (P<0.05) and a decrease in the level of interleukin-10 (IL- 10) by 33.3%, 36.6%, 43.3% (P<0.05) against the first group of animals, which indicated a marked imbalance of the cytokine profile and their important role in the pathogenesis of EAA and IS. The use of thiotriazoline and corvitin caused a decrease in the level of TNF-α by 35.2%, IL-6 by 33.7% and an increase in the content of IL-10 by 47.0% (P<0.05) in the blood compared to the group of animals before correction at EAA and IS on the 24th day of the experiment, which indicated their cytokine-correcting effect. The dynamics (1st, 14th, 24th days) of the development of allergic alveolitis in combination with immobilization stress causes noticeable disturbances in the indicators of the nitric oxide (NO) system in the lungs, which are manifested by a gradual increase in the content of stable metabolites of NO by 75.0%, respectively , 125.0%, 140.0% (P<0.05), the total activity of NOS (synthase) by 72.2%, 111.1%, 122.2% (P<0.05) and a decrease in the level of L -arginine by 31.6%, 50.0%, 55.0% (P<0.05) compared to the control. The combined use of thiotriazoline and corvitin led to a decrease in the content of stable metabolites of nitric oxide by 37.5%, the total activity of NOS by 35.0% (P<0.05) in the lungs, and an increase in the level of L-arginine by 55.5% (P<0 .05) against a group of animals on the 24th day of development of EAA and IS without the influence of these drugs, which indicated their positive corrective effect on disturbed metabolic processes. Experimental allergic alveolitis associated with immobilization stress (1st, 14th, 24th days) causes significant changes in lipoperoxidation processes - an increase in the content of diene conjugates (DC) in the lungs by 64.8%, 80.0%, respectively 90.4% (P<0.05), malondialdehyde (MDA) by 68.7%, 74.8%, 88.6% (P<0.05) and a significant decrease in the content of ceruloplasmin (CP) by 31, 5%, 40.8%, 44.3% (P<0.05), superoxide dismutase (SOD) activity by 27.8%, 34.7%, 44.1% (P<0.05), catalase ( CT) by 48.5%, 52.1%, 55.1% (P<0.05) relative to the intact group of animals, which indicated the development of oxidant stress, which increased the course of this immune complex pathology and stress.
The use of thiotriazoline together with corvitin caused a decrease in the content of DC and MDA by 29.8% and 16.1%, respectively (P<0.05) and an increase in the activity of SOD, CT and the content of CP in the lungs by 45.0%, 80.4% , 50.3% (P<0.05) against a group of animals with allergic alveolitis and stress on the 24th day of the experiment, which were not exposed to these medicinal agents, which indicated their antioxidant effect on disturbed markers of the prooxidant-antioxidant system. Scientific novelty of the obtained results. For the first time, the pathogenetic features of disorders of immune processes, cytokine status, processes of lipoperoxidation and antioxidant protection and the nitric oxide system in the blood and lungs were established, and their participation in the mechanisms of formation of experimental allergic alveolitis and immobilization stress was proven. It was shown for the first time that experimental allergic alveolitis combined with immobilization stress leads to a violation of immune homeostasis, which is manifested by the suppression of cellular immunity against the background of stimulation of humoral immunity at all stages of their development with an advantage on the 24th day of the experiment. For the first time, an imbalance of cytokines was revealed - an increase in pro-inflammatory cytokines in conditions of a decrease in anti-inflammatory cytokines during all periods of the formation of experimental allergic alveolitis and immobilization stress with dominance on the 14th and 24th days of the experiment. For the first time, it was determined that combined experimental allergic alveolitis with immobilization stress is accompanied by stimulation of pro-oxidant processes against the background of significant inhibition of the antioxidant system during all stages of their development with the greatest degree of expression on the 14th and 24th days of the experiment. For the first time, it was shown that during all periods of the formation of combined experimental allergic alveolitis and immobilization stress, there is a noticeable increase in the content of secondary metabolites of nitric oxide, the total activity of NO synthases in conditions of a decrease in the concentration of L- arginine in the lungs, with an advantage on the 24th day of the experiment. For the first time, the antioxidant, immunomodulatory, and cytokine- correcting effect of thiotriazoline together with corvitin was proven under the conditions of the development of experimental allergic alveolitis and immobilization stress. Practical significance of the obtained results. The obtained research results deepen and expand modern ideas about the mechanisms of development of experimental allergic alveolitis and immobilization stress and can be used in further scientific research and pedagogical work. The proven antioxidant and immunocorrective effect of thiotriazoline and corvitin indicates the perspective and feasibility of their further research and study in the experiment and in the clinic (pulmonology, allergology, neurology, psychiatry) with the aim of correcting disorders of metabolic and immune processes under the conditions of the development of experimental allergic alveolitis and immobilization stress and development of methodological guidelines. The results of the study are implemented in the educational process at the Department of Pathological Physiology of the Ivano-Frankivsk National Medical University, Ternopil National Medical University named after I. Ya. pathology of the Lviv Medical University, which is confirmed by acts of implementation.
Key words: experimental allergic alveolitis, immobilization stress, lipid peroxidation, antioxidant system, nitric oxide system, lymphocytes, cytokines, corvitin, thiotriazoline, lung tissue homogenate, blood.

https://drive.google.com/file/d/1pCM6bpFNRWIN6_F9Xhe2TI1H6qHEPunj/view?usp=sharing