МАРКЕРИ ФЕРТИЛЬНОГО ПОТЕНЦІАЛУ ЧОЛОВІКІВ НА ТЛІ НАДМІРНОЇ МАСИ ТІЛА ТА ОЖИРІННЯ

Козопас Н.М. Маркери фертильного потенціалу чоловіків на тлі надмірної маси тіла та ожиріння. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії за спеціальністю 222 – Медицина (22 – Охорона здоров’я). – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, Львів, 2022. Дисертаційна робота присвячена оцінці особливостей фертильного статусу чоловіків та функціональних метаболічних змін при надмірній масі тіла / ожирінні. Представлене дослідження було здійснене на базі кафедри клінічної лабораторної діагностики факультету післядипломної освіти Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького впродовж 2018–2022 років. Попри наявність значної кількості наукових досліджень щодо впливу надлишково накопиченої жирової тканини в тілі на репродуктивну систему, патогенетичні механізми взаємозв’язку між ожирінням та порушенням плідності в чоловіків досі залишаються не до кінця висвітленими та створюють поле для дискусій. Вплив зростання індексу маси тіла (ІМТ) на показники фертильного потенціалу є предметом обговорень, оскільки результати досліджень у цій галузі доволі часто є суперечливими. Наприклад, метааналіз MacDonald та співавт., 2010 р. включав дані від 4853 пацієнтів та не виявив кореляції ІМТ із концентрацією та кількістю сперматозоїдів. На противагу, аналогічна робота Sermondade та співавт., 2013 р. свідчить, що при високих показниках ІМТ у чоловіків майже вдвічі зростає поширеність азооcпермії та олігозооспермії. Водночас емпіричні дані низки експериментів вказують на те, що втрата ваги може сприяти покращенню якості еякуляту. З’ясування суперечливих питань та прогалин у розумінні взаємозв’язків між ожирінням та плідністю чоловіків є актуальною проблемою сучасної науки та потребує глибшого та системного аналізу маркерів, що потенційно можуть свідчити про функціональний стан репродуктивної системи за умов впливу стресових чинників, зокрема, за надмірного накопичення жирової тканини в організмі. Отримані результати в перспективі дозволять удосконалити прогностичні підходи щодо тактики комплексного лікування безпліддя в чоловіків на тлі надмірної маси тіла / ожиріння з метою досягнення бажаної вагітності. Для реалізації поставленої мети та сформульованих завдань представлена робота була здійснена у двох напрямках: перший напрямок полягав у проведенні проспективного дослідження із залученням чоловіків репродуктивного віку, яких розподілили на три групи залежно від розрахованого ІМТ. У рамках цього етапу були проаналізовані основні параметри спермограми та біохімічні показники еякуляту (згідно з Керівництвом Всесвітньої організації охорони здоров’я по аналізу еякуляту людини, 2010), які є рутинними (стандартними) методиками при діагностиці репродуктивних порушень у чоловіків. Також були проведені додаткові дослідження: визначення концентрації лептину, прозапальних цитокінів IL-1β, IL-18 у спермальній плазмі; концентрації Са 2+ , K + , Na + у спермальній плазмі та сперматозоїдах. Другий напрямок роботи передбачав експериментальне вивчення впливу короткотривалого висококалорійного харчування самців щурів на морфометричні параметри тіла та органів; метаболічні показники крові (ліпідограма, вміст глюкози, лептину), показники функціонального стану та мітохондріального дихання сперматозоїдів. Статистичну обробку отриманих результатів проводили, використовуючи стандартні методи описової статистики, порівняльного та кореляційного аналізів. Усі результати вважалися вірогідними за умови, якщо р < 0.05. Згідно з розробленим дизайном було проведено обстеження та аналіз зразків еякуляту від 120 чоловіків віком 25–38 років. Залежно від розрахованого ІМТ було сформовано 3 групи: контрольна група (КГ) включала 30 практично здорових чоловіків, які проходили профілактичне обстеження у Медичному Центрі «Інтерсоно», і їхні показники ІМТ були у межах норми (ІМТ 18.5–24.9); група з надмірною масою тіла (ГНМТ) налічувала 50 чоловіків із ІМТ 25.0–29.9; група з ожирінням (ГО) – 40 пацієнтів з ІМТ > 30.0. Виявлено, що у чоловіків із надмірною масою тіла та з ожирінням значно погіршувалися основні показники спермограми: концентрація сперматозоїдів зменшилась у 1.4–2.3 раза (p = 0.04), загальна кількість статевих клітин в еякуляті у 2.1–2.5 раза (p = 0.04), відсоток прогресивно рухливих сперматозоїдів знижувався у 1.3 раза лише серед пацієнтів з надмірною масою тіла (p = 0.04); життєздатність сперматозоїдів у групах порівняння знижувалася у 1.2 раза (p < 0.05), а кількість нормальних морфологічних форм статевих клітин – у 2.1–2.4 раза (р < 0.05). Додаткові розрахунки концентрації / загальної кількості рухливої сперми, детальна морфологічна оцінка сперматозоїдів та визначення індексів множинних дефектів підтвердили несприятливий вплив зростання маси тіла на якість еякуляту. Встановлено, що у пацієнтів з ожирінням медіана концентрації фруктози була нижчою у 1.2 раза (p < 0.05), водночас у ГНМТ рівні фруктози спермальної плазми не суттєво відрізнялися від КГ. Зважаючи на те, що процеси фруктолізу можуть бути більш інтенсивними при високій концентрації сперматозоїдів, була здійснена корекція рівнів фруктози з урахуванням концентрації статевих клітин, а також концентрації рухливої сперми. Показано, що чоловіки з ожирінням мали у 1.3–1.4 раза нижчі скориговані рівні фруктози спермальної плазми в порівнянні з КГ (p < 0.05). З огляду на дані, що описані вище, запропоновано розглядати скориговані значення фруктози як більш надійний маркер при оцінці фертильного статусу чоловіків. Показано, що у ГНМТ та ГО медіана концентрації лимонної кислоти спермальної плазми була вищою у 1.8–2.0 раза (p < 0.05), а показники цинку – у 1.6–2.4 раза (p < 0.05). Встановлено, що у пацієнтів із надмірною масою тіла та ожирінням концентрації IL-18 знижувалися у 1.4–1.5 раза (p < 0.05), натомість вміст IL-1β був нижчими у 2.0–2.4 раза (p < 0.05) і становив 10.2 [6.3–17.1] пг/мл у групі з надмірною масою тіла, 9.8 [1.38–5.33] пг/мл – у групі з ожирінням (p < 0.05). Ці дані свідчать про відсутність ознак прозапального стану в репродуктивному тракті чоловіків при ожирінні. Було виявлено помірний негативний кореляційний зв’язок між IL-18 та концентрацією цинку в еякуляті (r = -0.38, р < 0.05), що, ймовірно, можна пояснити захисною дією цинку у відповідь на ушкоджувальні патологічні процеси, пов'язані зі збільшенням ІМТ. Показано, що для пацієнтів з надмірною масою тіла та з ожирінням були притаманні композиційні зміни еякуляту в системі «середовище – клітина»: внутрішньоклітинне зростання Ca 2+ та зниження K + ; позаклітинно – навпаки, реєструвалися вищі концентрації K + та нижчі показники Ca 2+ (р<0.05). Представлене дослідження є першим проспективним дослідженням, що комплексно оцінює основні та додаткові параметри спермограми, композиційний склад спермальної плазми на предмет маркерів придаткових статевих залоз, лептину, неорганічних іонів, прозапальних цитокінів при надмірній масі тіла / ожирінні у чоловіків репродуктивного віку. Підтверджено, що зростання ІМТ несприятливо позначається на вище зазначених параметрах та, відповідно, негативно впливає на фертильний потенціал пацієнтів. У рамках другої частини дисертаційної роботи, як інструмент для підтвердження наявних або з’ясування суперечливих спостережень, що отримані під час досліджень біологічного матеріалу чоловіків, були використані тваринні моделі. У експеримент було включено 30 статевозрілих білих нелінійних щурів-самців масою тіла 250–300 г, яких випадковим чином розподілили на 3 групи (по 10 самців у кожній). Контрольна група (КГ) отримувала стандартний раціон; перша дослідна група тварин перебувала на дієті з високим вмістом жиру (ВЖД) – стандартний корм був доповнений смальцем таким чином, щоб частка жиру становила 45% добового калоражу; друга дослідна група споживала корм з високим вмістом жиру та цукру (ВЖЦД) – 40 % ккал складали жири та 46 % припадало на вуглеводи. Продемонстровано, що після 7 тижнів перебування щурів на дієті з високим вмістом жиру та цукру, коефіцієнт вісцерального жиру зріс на 40 % (р < 0.05), що вказує на значні метаболічні зміни у цій групі та, відповідно, більш ефективне застосування ВЖЦД для моделювання ожиріння в щурів. Запропоновані висококалорійні раціони не спричинили значних змін таких показників, як приріст маси тіла, індекс Лі та гонадосоматичний індекс (p > 0.05). Показано, що на тлі висококалорійного харчування в щурів виявляли характерні ознаки дисліпідемії – концентрації загального холестерину плазми крові у ВЖД групі зросли на 24.5% (p = 0.035), у ВЖЦД – на 29.8% (p = 0.035); коефіцієнт атерогенності – зріс у 1.8–2.1 раза (р < 0.05); а вміст фракції ліпопротеїнів низької щільності у групах зростав у 1.9–2.1 раза (p = 0.025). Не виявлено суттєвої різниці щодо рівня глюкози плазми крові між групами (p > 0.05). Концентрація лептину крові щурів до початку експерименту між групами не відрізнялася і становила 0.4–0.44 нг/мл (p = 0.05), а після 7 тижнів застосування дієт спостерігалося незначне зростання рівнів лептину в усіх групах тварин: у ВЖД на 9.0%, у ВЖЦД – на 14% від початкових даних (p < 0.05). При аналізі епідидимальної сперми виявлено, що рухливість сперматозоїдів
погіршувалася: у ВЖД групі була на 13% нижчою, а серед тварин, що споживали ВЖЦД, – на 18% порівняно з КГ (p < 0.05). Загальна кількість виділених сперматозоїдів та життєздатність не показали істотної різниці між групами (p > 0.05). У представленій роботі вперше в Україні описано функціональний стан мітохондрій інтактних сперматозоїдів на тлі дієт-індукованого ожиріння. Було показано, що серед тварин на ВЖЦД базальна швидкість дихання сперматозоїдів становила 0.040 ± 0.013 нМ/О 2 /10млн.клітин/хв та майже вдвічі перевищувала показники контролю (p = 0.015). Максимальна швидкість дихання, що є мірою здатності клітин реагувати на підвищену потребу в енергії, у ВЖЦД групі тварин була вищою на 30% (p = 0.04). Реєструвалося зниження резервної дихальної здатності мітохондрій сперматозоїдів на тлі харчування висококалорійними дієтами, однак статистично значущої різниці між групами не виявлено (p > 0.05). Показано, що оптимальна концентрація протонофора для досягнення максимальних показників дихання інтактних статевих клітин становила 0.5 мкМ/л FCCP (карбоніл-ціанід-p-трифлорметоксифенілгідразону). Підтверджено, що вимірювання споживання кисню є досить чутливим маркером функціонального стану мітохондрій. Отримані результати доповнюють наукові дані у сфері біоенергетики сперматозоїдів за фізіологічних умов та дії різних зовнішніх чинників, а також розширюють розуміння впливу надмірного відкладення жирової тканини на показники фертильного потенціалу чоловіків.
Ключові слова: безпліддя чоловіків, фертильний потенціал, надмірна маса тіла / ожиріння, спермограма, спермальна плазма, лептин, ліпідограма, висококалорійні дієти, мітохондріальне дихання сперматозоїдів.

SUMMARY

Kozopas N.M. Markers of male fertility potential against the background of overweight and obesity. – Ph.D. Thesis Manuscript.

Dissertation to obtain the degree of Doctor of Philosophy, specialty 222 – Medicine (22 – Healthcare). – Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ministry of Health of Ukraine, Lviv, 2022.

The dissertation is devoted to the evaluation of the features of fertility status and functional metabolic changes in overweight / obese men. The presented research was carried out based on the Department of Clinical Laboratory Diagnostics of the FPGE of Danylo Halytsky Lviv National Medical University during 2018 – 2022. Despite the presence of a significant amount of scientific investigations related to the impact of excessively accumulated adipose tissue in the body on the reproductive system, the mechanisms of the interaction between obesity and male infertility remain incompletely elucidated. The influence of increasing body mass index (BMI) on fertility potential is also a debatable issue, as research results in this area are often conflicting. For example, a meta- analysis by MacDonald et al., 2010 included data from 4853 patients, and found no correlation between BMI and sperm concentration or total count of spermatozoa. In contrast, a similar work by Sermondade et al., 2013 showed that with BMI growth the prevalence of  azoospermia and oligozoospermia increased by almost double. Simultaneously, empirical data from some experiments indicate that weight loss can improve sperm quality.
The controversial issues and gaps in understanding the relationship between obesity and male fertility are actual problems of modern science. A deeper and more systematic analysis of markers that can potentially indicate the functional state of the reproductive system under the influence of stress factors, particularly excessive adiposity, is needed. In the future, the obtained results would allow for improving prognostic approaches regarding the tactics of
complex male infertility treatment against the background of excess body weight and obesity to achieve the desired pregnancy. According to the study design, appropriate goals, tasks, the presented work was carried out in two approaches. The first direction consisted in conducting a prospective study involving men of reproductive age, who were divided into three groups depending on the previously calculated BMI. As part of this stage, sperm analysis and male accessory sex gland markers detection were performed (according to the World Health Organization Guidelines for laboratory manual examination and processing of human semen, fifth edition, 2010). These parameters are routine (standard) methods in the diagnostics of male reproductive disorders. Additional studies were also performed: seminal leptin concentration, pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-18, concentrations of Ca 2+ , K + , Na + in seminal plasma and spermatozoa were determined. The second direction of our work consisted of an experimental study: we investigated the short-term high-calorie nutrition effect of male rats on the body and organ morphometric parameters; blood metabolic changes (lipid profile, glucose, and leptin content), indicators of the functional state and sperm mitochondrial oxygen consumption. The standard methods of descriptive statistics, comparative and correlation analyses were used for processing the obtained results. The difference between groups was considered as significant if p < 0.05. We analyzed the sperm samples from 120 patients (25–38 years old) following the developed work design. Participants were examined and divided into 3 groups depending on the previously calculated BMI: the control group (CG) included 30 practically healthy men, who underwent a preventive examination at the "Intersono" Medical Center and whose BMI were within the normal range (BMI 18.5–24.9); the group with excess body weight (overweight) consisted of 50 men with a BMI of 25.0–29.9; obese group (OB) – 40 patients with BMI > 30.0. It was found that the main sperm parameters of the overweight and obese men were significantly worsened: the sperm concentration decreased by 1.4–2.3 times (p = 0.04), the total sperm number – by 2.1–2.5 times (p = 0.04), the percentage progressively motile spermatozoa decreased by 1.3 times only among patients with overweight (p = 0.04); sperm viability in the groups of comparison decreased by 1.2 times (p < 0.05); the number of normal morphological sperm forms decreased by 2.1–2.4 times (p < 0.05). Additional calculations of the concentration/total motile sperm, detailed morphological evaluation of spermatozoa, and determination of the indices of multiple defects confirmed the adverse effect of increasing body weight on semen quality.
It was established that in obese patients, the median fructose concentration was 1.2 times lower (p < 0.01), while in the overweight group, sperm fructose levels did not significantly differ from the control group. Taking into account that the processes of fructolysis can be more intense with a high sperm concentration, the correction of fructose levels was carried out taking into account the sperm concentration, as well as the concentration of motile sperm. It was shown that obese men had 1.3–1.4 times lower adjusted levels of seminal fructose compared to CG (p < 0.05). It was proposed to consider the adjusted values of seminal fructose as a more reliable marker during assessing male fertility status. Furthermore, it was shown that the median concentration of seminal citric acid in overweight and obese men increased significantly by 1.8–2.0 times (p < 0.05), and seminal zinc increased by 1.6–2.4 times (p < 0.05). In addition, IL-18 levels decreased by 1.4–1.5 (p < 0.05), while IL-1β content was 2.0–2.4 times lower (p < 0.05) and was 10.2 [6.3–17.1] pg/ml in the overweight and 9.8  [1.38–5.33] pg/ml in the obese group (p < 0.05). These data do not confirm pro-inflammatory state in the reproductive tract of men with adiposity. A moderate negative correlation was found between IL-18 and zinc concentration in seminal plasma (r = -0.38, p < 0.05), that could probably be explained by the protective zinc effect in response to harmful pathological processes associated with a BMI increase. The sperm compositional changes in the "microenvironment – cell" system were detected in overweight and obese patients: intracellular increase of Ca 2+ and decrease of K + ; extracellularly – higher concentrations of K + and lower levels of Ca 2+ were recorded (р < 0.05). The presented study is the first comprehensive prospective study that evaluates the main and additional sperm parameters, the seminal composition, including markers of accessory sex glands, leptin, inorganic ions, pro-inflammatory cytokines in overweight / obese males. It has been confirmed that a BMI increase adversely affects the above-mentioned parameters and, accordingly, negatively affects the male fertility potential.
The animal models were used as the second direction of the presented work to confirm existing or clarify contradictory observations obtained during human studies. The experimental part included 30 sexually mature white non-linear male rats with a body weight of 250–300 g. All animals were randomly divided into 3 groups (10 males in each). The control group (CG) received a standard chow; the first experimental animal's group was on a high-fat diet (HFD) – the standard feed was supplemented with lard to achieve 45% of daily caloric intake by fat; the second experimental group consumed a diet with a high fat and sugar (HFHSD) – 40% of kсal of fats and 46% of carbohydrates. It was demonstrated that after 7 weeks of feeding a high-fat high-sugar diet, the visceral fat index significantly increased by 40% (p < 0.05), confirming significant metabolic changes in this group and, accordingly, a more effective application of HFHSD for modeling adiposity in rats. The proposed high-calorie diets did not cause significant changes in such indicators as body weight gain, Lee index, and gonadosomatic index (p > 0.05). It was confirmed that high-calorie nutrition during 7 weeks caused typical signs of dyslipidemia – the concentration of total cholesterol in the HFD rat's blood plasma increased by 24.5% (p = 0.035), in the HFHSD group – by 29.8% (p = 0.035); the atherogenic coefficient was higher by 1.8–2.1 times (р < 0.05); and the low-density lipoprotein fraction increased by 2.1 times (p = 0.025). No significant difference was found in blood plasma glucose levels between groups (p > 0.05). The mean leptin concentration before the start of the experiment did not differ between the groups and was 0.4–0.44 ng/ml (p = 0.05), and a slight increase of leptin levels was observed in all groups after 7 weeks of feeding diets: in the HFD by 9.0%, in the HFHSD – by 14% from the initial data (p < 0.05). The analysis of epididymal suspension showed that sperm motility worsened in the experimental groups: it was 13% lower in the HFD group, and 18% lower in the HFHSD group compared to the CG (p < 0.05). The total number of isolated spermatozoa and viability did not show a significant difference between the groups  (p > 0.05). In the presented work, for the first time in Ukraine, the mitochondrial functional state of intact spermatozoa is described against the background of diet-induced obesity. The basal respiration rate of spermatozoa was 0.040 ± 0.013  nM/O 2 /10 million cells/min among HFHSD animals and was almost twice as high as in CG (p = 0.015). The maximal mitochondrial oxygen consumption, which is a measure of the response cells’ ability to increase energy demand, was 30% higher in this group of rats (p = 0.04); decreasing of the mitochondria reserve respiratory capacity (spare respiratory capacity) was registered, but no statistically significant difference between the groups was found (p > 0.05). It was shown that the optimal concentration of the protonophore for achieving the maximum respiration of intact sperm cells was 0.5 μM/l FCCP. It has been confirmed the oxygen consumption measurement is a fairly sensitive marker of the mitochondrial functional state. The obtained results complement scientific data in the field of sperm bioenergetics under physiological conditions / impact of various external factors, and expand the understanding of the influence of excessive adiposity on the male fertility potential.
Keywords: male infertility, overweight/obesity, sperm analysis, seminal plasma, leptin, lipid profile, high-calorie diets, sperm mitochondrial respiration, oxygen consumption.

https://drive.google.com/file/d/1cq-E78kSGman6kYJHSDr7j6WGSFBaPzl/view?usp=sharing