МОРФОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ СТРУКТУРНИХ КОМПОНЕНТІВ МІЖХРЕБЦЕВОГО ДИСКУ В НОРМІ ТА ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ОПІОЇДНОМУ ВПЛИВІ / Morphological features of structural components of the intervertebral disc in health and experimental opioid exposure

АНОТАЦІЯ

Паньків М.В. Морфологічні особливості структурних компонентів міжхребцевого диску в нормі та при експериментальному опіоїдному впливі (експериментальне дослідження).

Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.

Дисертація на здобуття ступеня доктор філософії за спеціальністю 222 – Медицина, галузь знань 22 Охорона здоров’я – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького. Львів, 2022.

Дисертаційна робота присвячена експериментальному обґрунтуванню дослідження впливу наркотичного анальгетика налбуфіну дослідити структурні компоненти міжхребцевого диску в нормі та їх зміни на різних термінах експериментального опіоїдного впливу.

За допомогою комплексу макроскопічних (препарування, скелетування), морфологічних (мікроскопічні, ультрамікроскопічні, морфометричні), експериментальних (моделювання опіоїдного впливу) та статистичних методів вперше встановлено та проведено порівняння з подальшим описом особливостей структурних компонентів міжхребцевого диску щура в нормі та патоморфологічні зміни на різних термінах експериментального опіоїдного впливу впродовж 56-ти діб експериментального дослідження.

Підтверджено, що у щура налічується 13 хребців грудного відділу, вони мають тіло, дуги та відростки. Тіла грудних хребців мають призматичну форму і містять ямки для з′єднання з ребрами. На грудних хребцях чітко видно остисті відростки. По мірі віддалення хребця від краніального напрямку до каудального остисті відростки стають плоскішими та масивнішими. У поперековому відділі щура налічується 6 хребців. У порівнянні з хребцями грудного відділу вони відрізняються більшою масивністю. Нами встановлено, що тіла хребців по мірі віддалення з краніального напрямку до каудального набувають більшої масивності. Серед анатомічних елементів у хребців поперекового відділу чітко вирізняються ямка хребця, головка хребця та соскоподібний відросток. Особливістю остистих відростків хребців поперекового відділу є те, що вони плоскі та масивні, а їх довжина збільшується при наближені до краніального кінця і в подальшому знову зменшується наближаючись до каудального кінця.

У результаті проведеного мікроструктурного дослідження було встановлено, що міжхребцевий диск щура в нормі складається з драглистого (пульпозного) ядра та волокнистого (фіброзного) кільця. Міжхребцевий диск відділений від тіл хребців тонким шаром хрящової тканини замикальних пластинок та гіаліновим хрящем, що вкриває тіла сусідніх хребців. Від судин періосту хребця відгалужуються судини, що наближаються до міжхребцевого диска радіально – спереду, ззаду і з боків. У хрящовій тканині міжхребцевого диска судини не візуалізуються. Морфометричні дослідження показали, що товщина колагенових волокон, які формують задню поздовжню зв’язку становила 14.27 [11.23; 23.8] мкм і коливалась від мінімального значення у 5,85 мкм до максимального – 81,48 мкм. Товщина волокон передньої поздовжньої зв’язки була дещо меншою від таких у задній поздовжній зв’язці і становила 11.39 [9.05; 13.86] мкм із коливаннями від 5,55 мкм до 21,86 мкм. Ядро міжхребцевого диска інтактної групи тварин було рівномірним за товщиною із поступовим стоншенням його у дорзальному відділі. Товщина самого ядра становила 332.78 [298.32; 355.75] мкм із незначним коливанням від мінімального значення у 232,50 мкм до максимального зафіксованого нами у 378,09 мкм. Товщина капсули драглистого ядра становила 60.95 [51.02; 68.47] мкм із коливаннями від 37,68 мкм до 96,45 мкм. У результаті проведеного ультраструктурного дослідження встановлено, що у центральній зоні локалізується драглисте ядро та нечисельні нотохордальні клітини, а у периферичній зоні незначна кількість хондробластів, хондроцитів та фібробластів. Матрикс драглистого ядра об’ємний електронносвітлий.У центрі драглистого ядра колагенові фібрили відсутні або зустрічаються рідко. У периферичних ділянках драглистого ядра кількість фібрилярних структур дещо зростає. Ядро хондроцитів округлої або видовженої форми. На поверхні хондроцитів візуалізуються чисельні дрібні цитоплазматичні відростки. Зрілі хондроцити оточені капсулою, що містить дві зони: внутрішня зона світла, у ній зустрічається тонка сітка з дрібних філаментів, та зовнішня зона більш електроннощільна, у ній містяться дрібні фібрили колагенових волокон. Основними клітинними елементами волокнистого кільця є фібробласти та фіброцити, а також клітини хондробластичного диферону. Фібробласти та фіброцити локалізуються переважно в зовнішніх ділянках волокнистого кільця, а хондробласти та хондроцити – у внутрішніх відділах.

На мікроструктурному рівні через 7 діб нами було виявлено початкові явища структурної перебудови у вигляді розвитку помірних дегенеративних змін нотохордальних клітин драглистого ядра, а також розшарування колагенових волокон волокнистого кільця. У хондроцитах хрящових замикальних пластинок відзначали розвиток дистрофічних змін, що супроводжувались набуханням, просвітленням та вакуолізацією цитоплазми. Через 14 діб нами було встановлено зміни нотохордальних клітин драглистого ядра, а також деструкція колагенових волокон фіброзного кільця та ураження хрящової тканини міжхребцевого диска. У драглистому ядрі реєстрували розвиток некротичних змін нотохордальних клітин. В результаті відшарування колагенових волокон зовнішнього шару волокнистого кільця утворювались поздовжні порожнини. Встановлено, що починаючи з 21 – ої добинаростали деструктивні зміни у структурних елементах міжхребцевого диска. Унаслідок некротичних змін нотохордальних клітин у драглистому ядрі візуалізувались об’ємні безклітинні зони. У хрящовій тканині замикальних пластинок наростали виражені дистрофічні та некротичні зміни хондроцитів. Через 28 діб наростали виражені дегенеративні зміни у пульпозному ядрі, ураження колагенових волокон фіброзного кільця, а також пошкодження хрящової тканини замикальних пластинок. Колагенові пластини волокнистого кільця розташовувалися хаотично та зазнавали деструкції. У наслідок чисельних розривів колагенових волокон відзначали просочування у ділянки елементів драглистого ядра. Через 35 діб драглисте ядро було зменшене та деформоване. Нотохордальні клітини зустрічались рідко. У драглистому ядрі переважно локалізувались безклітинні зони з дещо ущільненим матриксом. Колагенові пластинки розташовувались хаотично. У вогнищах пошкодження волокнистого кільця відзначали появу ділянок мінералізації. Через 42 доби були присутні виражені структурні зміни у драглистому ядрі, а також у структурних елементах волокнистого кільця і хрящових замикальних пластинках. Кількість нотохордальних клітин була знижена. Між розшарованими колагеновими волокнами волокнистого кільця зустрічались щілини та поздовжні тріщини.

На основі проведеного морфометричного дослідження структурних компонентів міжхребцевого диску щурів через 7 діб експериментального опіоїдного впливу виявлено, що всі показники мали тенденцію до зниження, однак статистичної достовірності вона не мала. Наприкінці 14 доби експериментального опіоїдного впливу дистрофічні зміни у ядрі та у капсулі відбувалися нерівномірно. Так само нерівномірними були зміни у передній та задній поздовжніх зв’язках. Через 21 добу експериментального опіоїдного впливу залишається стійка тенденція щодо стоншення волокон саме задньої поздовжньої зв’язки. При цьому слід розглядати це в комплексі із потовщенням дорзальної частини ядра диску. Через 28 доби спостерігали стійке зменшення товщини волокон задньої поздовжньої, збільшення товщини волокон передньої поздовжньої зв’язок, у порівнянні із контролем, з одночасним зменшенням товщини ядра та його капсули у порівнянні із поперенім терміном. Через 35 та 42 доби всі показники, за винятком товщини волокон задньої поздовжньої зв’язки, характеризувалися великою варіативністю товщини – спостерігалися як ділянки стоншення, так і ділянки набряку із різким потовщенням. У задній поздовжній зв’язці натомість спостерігалась деградація товстих волокон в глибині зв’язки.

На ультраструктурному рівні через 7 діб експериментального опіоїдного впливунамивиявлено помірні дегенеративні зміни окремих нотохордальних клітин. У хондроцитах реєстрували дегенеративні зміни, що супроводжувались появою в цитоплазмі об’ємних вакуолей. Цитоплазматичні відростки хондроцитів зменшувались в об’ємі, вкорочувались, зазнавали фрагментації та руйнування. Через14 доби прогресували ознаки експериментального опіоїдного впливу, що проявлялися наростанням деструкції цитоплазматичних відростків у хондроцитах. В окремих ділянках волокнистого кільця спостерігали інтенсивну осміофільність та потовщення фібрил колагенових волокон фіброзного кільця. Реєстрували вогнищеве руйнування колагенових волокон.Наприкінці 21 доби нами спостерігали, розвиток некротичних змін нотохордальних клітин, а також хондроптозу хондроцитів. Виражені деструктивні зміни виявляли і в хондроцитах. В окремих хондроцитах більшість цитоплазматичних відростків зазнавали деструкції. Через 28 діб зміни прогресували, це проявлялося тим, що у пульпозному ядрі виникали обширні безклітинні зони. Також відзначали потовщення окремих фібрил колагенових волокон пульпозного ядра. Нотохордальні клітини та більшість хондроцитів зазнавали некротичних змін. Через 35 діб виявлено виражені зміни у драглистому ядрі, що проявлялись наявністю безклітинних зон, з дещо ущільненим матриксом. Більшість хондроцитів зазнавала виражених деструктивних змін. Одночасно дегенеративні зміни розвивались у фібробластах. Наприкінці 42 добинотохордальні клітини візуалізувались рідко, перебували у стані некрозу. Більшість хондроцитів також зазнавали альтеративних змін. Проте поряд з некротизованими хондроцитами зустрічались клітини з більш збереженою структурою, у яких виявляли розвиток дегенерації цитоплазматичних органел. На мікроструктурному рівні при відміні опіоїдного впливу наприкінці 56 доби нами було виявлено, що драглисте ядро було деформоване та зменшене в об’ємі, клітинні елементи не візуалізувались. Колагенові волокна фіброзного кільця зруйновані, а колагенові пластинки зазнавали значної деструкції. В результаті морфометричного дослідження при двотижневій відміні опіоїдного впливу добре видно динаміку, що проявлялась зменшенням розмаху всіх елементів «ящиків з вусами» (боксплотів). При цьому такі прояви дегенеративних змін не мали суттєвої динаміки у підгрупі після двох тижнів відміни, що може свідчити про декомпенсацію та хронічний характер змін. При цьому, як у випадку із волокнами задньої поздовжньої зв’язки, суттєвої динаміки після 2 тижнів відміни не спостерігалось. У групі відміни позитивним можна вважати лише зменшення ділянок із набряком ядра, що проявляється морфометрично зменшенням максимального значення, однак показники центральної тенденції залишались значно меншими за контрольну групу, що також свідчить про переважання декомпенсаторних змін. Значення товщини капсули ядра у підгрупі відміни не мали суттєвої динаміки і лишалися за всіма характеристиками наближеними до таких на 6 тижні. На ультраструктурному рівні, при відміні опіоїдного впливу, через 56 доби нами було виявлено виражені альтеративні зміни у нотохордальних клітинах та у переважній більшості хондроцитів. Матрикс драглистого ядра ущільнювався, у ньому виявляли потовщені колагенові фібрили. Більшість клітинних елементів драглистого ядра перебували на різних стадіях некрозу, а деякі хондроцити – хондроптозу. Фібрили колагенових волокон розташовувались нещільно, розшаровувались, розпадались та зазнавали лізису.

Результати проведених досліджень дадуть можливість створити фундаментальне морфологічне підгрунтя для подальшого експериментального дослідження патологічного впливу препаратів опіоїдної групи на системи та органи з метою подальшої розробки практичних рекомендації щодо тривалості та дозування при застосуванні препаратів даної групи. Результати отриманої нами роботи мають практичне значення для експериментальної морфології, хірургічної травматології, анестезіології та наркології, оскільки можуть бути патоморфологічним та морфологічним підгрунтям для розробки нових методів диференційної діагностики, профілактики та лікування можливих токсичних опіоїдних впливів на структурні компоненти міжхребцевого диску серед наркозалежних хворих.

Отримані результати, що стосуються динаміки змін структури компонентів міжхребцевого диску при експериментальному опіоїдному впливі, є фундаментальною морфологічною базою, на дані якої можуть в своїх дослідженнях спиратися морфологи при вивченні питань експериментального токсичного впливу на структурні компоненти міжхребцевого диску та практичні хірурги - травматологи при лікуванні пацієнтів з ураженнями хребта, що відносяться до данної нозологічної групи.

Ключові слова: щур, опіоїдний анальгетик,налбуфін,міжхребцевий диск, експеримент.

ABSTRACT

Pankiv M. V. Morphological features of structural components of the intervertebral disc in health and experimental opioid exposure (experimental research).

Qualification scientific work on the rights of a manuscript.

Dissertation for the degree of Doctor of philosophy in major 222 – Medicine, (22 Health care), Danylo Halytskyi Lviv National Medical University,Lviv, 2022.

This dissertation deals with the experimental confirmation of study of the effect of narcotic analgesic nalbuphine on the structural components to reseach the intervertebral disc in health and their changes in different terms of experimental opioid exposure.

Using a complex of macroscopic (preparation, skeletization), morphological (microscopic, ultramicroscopic, morphometric), experimental (modeling of opioid exposure) and statistical methods were first established and compared with a subsequent description of the features of the structural components of the rat intervertebral disc in health and pathomorphological changes at different terms of experimental opioid exposure during 56 days of experimental research.

It is confirmed that the rat has 13 vertebrae of the thoracic region, they have a body, arches and processes. The bodies of the thoracic vertebrae are prismatic and contain fossae for connecting to the ribs. Spinous processes are clearly visible on the thoracic vertebrae. As the vertebra moves away from the cranial direction to the caudal one, the spinous processes become flatter and more massive. There are 6 vertebrae in the rat's lumbar region. Compared to the vertebrae of the thoracic region, they are more massive. We have found that the vertebral bodies acquire greater massiveness as they move away from the cranial direction to the caudal one. Among the anatomical elements in the lumbar vertebrae, the vertebral fossa, vertebral head and papillary process are clearly distinguished. The peculiarity of the spinous processes of the lumbar vertebrae is that they are flat and massive, and their length increases when approaching the cranial end and then decreases again when approaching the caudal end.

As a result of the conducted microstructural research it was found that the rat intervertebral disc in health consists of a gelatinous (pulposus) nucleus and a fibrous ring. The intervertebral disc is separated from the vertebral bodies by a thin layer of cartilage tissue of the terminal plates and hyaline cartilage covering the bodies of neighboring vertebrae. From the vessels of the vertebral periosteum, vessels branch off, approaching the intervertebral disc radially – anteriorly, posteriorly and laterally. In the cartilage tissue of the intervertebral disc, vessels are not visualized. Morphometric examinations have shown that the thickness of the collagen fibers forming the posterior longitudinal ligament was 14.27 [11.23; 23.8] microns and ranged from a minimum value of 5.85 microns to a maximum value of 81.48 microns. The thickness of the fibers of the anterior longitudinal ligament was slightly less than that of the posterior longitudinal ligament and was equal to 11.39 [9.05; 13.86] microns with a range from 5.55 microns to 21.86 microns. The nucleus of the intervertebral disc of the Intact group of animals was uniform in thickness with gradual thinning in the dorsal part. The thickness of the nucleus itself was 332.78 [298.32; 355.75] microns with a slight range from the minimum value of 232.50 microns to the maximum recorded by us at 378.09 microns. The thickness of the gelatinous nucleus capsule was 60.95 [51.02; 68.47] microns with a range from 37.68 microns to 96.45 microns. As a result of the ultra-structural study, it was found that in the central zone the gelatinous nucleus and a few notochordal cells are localized, and in the peripheral zone a few chondroblasts, chondrocytes and fibroblasts are localized. The gelatinous nucleus matrix is three-dimensional electron-luminous. In the center of the gelatinous nucleus, collagen fibrils are absent or rare. In the peripheral areas of the gelatinous nucleus, the number of fibrillar structures increases slightly. The nucleus of chondrocytes is rounded or elongated in shape. Numerous small cytoplasmic processes are visualized on the surface of chondrocytes. Mature chondrocytes are surrounded by a capsule containing two zones: the inner zone of light, which contains a thin reticulum of small filaments, and the outer zone is more electron-dense, it contains small fibrils of collagen fibers. The main cellular elements of the fibrous ring are fibroblasts and fibrocytes, as well as chondroblastic diferon cells. Fibroblasts and fibrocytes are localized mainly in the outer parts of the fibrous ring, and chondroblasts and chondrocytes are localized in the inner parts.

At microstructural levels in 7 days we have identified the initial phenomena of structural adjustment in the form of development of moderate degenerative changes in the notochordal cells of the gelatinous nucleus, as well as stratification of collagen fibers of the fibrous ring. The development of dystrophic changes accompanied by swelling, lucidity and vacuolization of the cytoplasm was noted in the chondrocytes of the cartilage arch laminae. In 14 days we have established changes in the notochordal cells of the gelatinous nucleus, as well as destruction of collagen fibers of the fibrous ring and lesion to the cartilage tissue of the intervertebral disc. The development of necrotic changes in notochordal cells was recorded in the gelatinous nucleus. As a result of lamination of collagen fibers of the outer layer of the fibrous ring longitudinal cavities were created. It was found that starting from the 21st day destructive changes in the structural elements of the intervertebral disc were increasing. As a result of necrotic changes in notochordal cells in the gelatinous nucleus, extensive cell-free zones were visualized. Pronounced dystrophic and necrotic changes in chondrocytes increased in the cartilage tissue of the arch laminae. In 28 days degenerative changes in the nucleus pulposus, lesion to the collagen fibers of the fibrous ring, as well as an effect to the cartilage tissue of the arch laminae were increasing. The collagen repair patches of the fibrous ring were located randomly and underwent destruction. As a result of numerous breaks in collagen fibers, seepage into areas of gelatinous nucleus elements was noted. In 35 days gelatinous nucleus was reduced and deformed. Notochordal cells were rarely met. In the gelatinous nucleus, cell-free zones with a somewhat compacted matrix were mainly localized. The collagen repair patches were arranged randomly. In the affected areas of the fibrous ring, the appearance of mineralization areas was noted. In 42 days there were pronounced structural changes in the gelatinous nucleus, as well as in the structural elements of the fibrous ring and cartilaginous arch laminae. The number of notochordal cells was reduced. Clefts and longitudinal fractures were found between the laminated collagen fibers of the fibrous ring.

Based on the conducted morphometric study of structural components of the rat intervertebral disc in 7 days of experimental opioid exposure revealed that all indicators tended to decrease, but it did not have statistical control status. At the end of 14 days after experimental opioid exposure, dystrophic changes in the nucleus and capsule occurred unevenly. Changes in the anterior and posterior longitudinal ligaments were also uneven. In 21 days of experimental opioid exposure remains a steady trend towards thinning the fibers of the posterior longitudinal ligament. However, this should be considered in combination with the thickening of the dorsal part of the disc nucleus. In 28 days there was a steady decrease in the thickness of the posterior longitudinal ligament fibers, an increase in the thickness of the anterior longitudinal ligament fibers, compared to the control, with a simultaneous decrease in the thickness of the nucleus and its capsule compared to the previous period. In 35 and 42 days all indicators, except for the thickness of the fibers of the posterior longitudinal ligament, were characterized by a large variability in thickness – both areas of thinning and areas of edema with a sharp thickening were observed. In the posterior longitudinal ligament, degradation of thick fibers in the depth of the ligament was observed.

At ultrastructural levels in 7 days of experimental opioid exposurewedetected moderate degenerative changes in individual notochordal cells. Degenerative changes were recorded in chondrocytes, accompanied by the appearance of three-dimensional vacuoles in the cytoplasm. Cytoplasmic processes of chondrocytes were decreasing in volume, shortening, and underwent fragmentation and destruction. In14 days signs of experimental opioid exposure, manifested by increased destruction of cytoplasmic processes in chondrocytes, were developed. In some areas of the fibrous ring, intense osmiophilia and thickening of the fibrils of the collagen fibers of the fibrous ring were observed. Focal destruction of collagen fibers was recorded. At the end of the 21st day we were observing, the development of necrotic changes in notochordal cells, as well as chondroptosis of chondrocytes. Pronounced destructive changes were also found in chondrocytes. In some chondrocytes, most of the cytoplasmic processes were destroyed. In 28 days the changes were progressing, this was manifested by the fact that extensive cell-free zones appeared in the nucleus pulposus. Thickening of individual fibrils of the collagen fibers of the nucleus pulposus was also noted. Notochordal cells and most chondrocytes underwent necrotic changes. In 35 days pronounced changes in the gelatinous nucleus were detected, that manifested by the presence of cell-free zones, with a somewhat compacted matrix. Most chondrocytes underwent pronounced destructive changes. At the same time, degenerative changes developed in fibroblasts. At the end of the 42nd day notochordal cells were rarely visualized and were in a state of necrosis. Most chondrocytes also underwent alterative changes. However, along with necrotized chondrocytes, there were cells with a more preserved structure that showed the development of degeneration of cytoplasmic organelles. At the microstructurallevel, when the opioid influence was abolished at the end of the 56th day, we found that the gelatinous nucleus was deformed and reduced in volume, and cellular elements were not visualized. The collagen fibers of the fibrous ring were destroyed, and the collagen repair patches were significantly destroyed. As a result of morphometric examination with a two-week abolition of opioid exposure clearly show the dynamics, which was manifested by a decrease in the scope of all elements of "Boxes and Whiskers graph" (boxplots). At the same time, such manifestations of degenerative changes did not have significant dynamics in the subgroup after two weeks of abolition, which may indicate decompensation and the chronic nature of changes. At the same time, as in the case of posterior longitudinal ligament fibers, no significant dynamics were observed after 2 weeks of abolition. In the group of abolition, only a decrease in areas with nuclear edema can be considered positive, which is manifested morphometrically by a decrease in the maximum value, but the indicators of the central trend remained significantly lower than in the control group, which also indicates the predominance of decompensatory changes. The values of the nucleus capsule thickness in the abolition subgroup did not have significant dynamics and remained close to those at week 6 in all characteristics. At the ultrastructural level, when opioid exposure is abolished, in 56 days we have identified pronounced alterative changes in notochordal cells and in the vast majority of chondrocytes. The matrix of the gelatinous nucleus was compacted, thickened collagen fibrils were found in it. Most of the cellular elements of the gelatinous nucleus were at various stages of necrosis, and some chondrocytes had the features of chondroptosis. The fibrils of the collagen fibers were loosely located, laminated, decomposed, and underwent lysis.

The results of the conducted studies will make it possible to create a fundamental morphological basis for further experimental research of the pathological effect of opioid group drugs on systems and organs in order to further develop practical recommendations on the duration and dosage when using drugs of this group. The results of our work are of practical importance for experimental morphology, surgical traumatology, anesthesiology and addictiology, since they can be a pathomorphological and morphological basis for the development of new methods for differential diagnosis, prevention and treatment of possible toxic opioid exposures on the structural components of the intervertebral disc among drug-addicted patients.

The results obtained concerning the dynamics of changes in the structure of intervertebral disc components during experimental opioid exposure are a fundamental morphological basis, the data of which can be used in their research by morphologists when studying the issues of experimental toxic effects on the structural components of the intervertebral disc and practical trauma surgeons in the treatment of patients with spinal lesions belonging to this nosological group.

Keywords: rat, opioid analgesic, nalbuphine, intervertebral disc, experiment.

ЕЦП