Особливості мутаційного статусу при гострій лімфобластній лейкемії в дітей

АНОТАЦІЯ

Винницька О.А. Особливості мутаційного статусу при гострій лімфобластній лейкемії в дітей. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.

         Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 228-Педіатрія (22 – Охорона здоров’я) – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького. Львів, 2022.

         Сучасна молекулярно-генетична діагностика гострої лімфобластної лейкемії (ГЛЛ) базується на визначенні специфічних генетичних порушень, які пов’язані зі злоякісною трансформацією клітин. Генодіагностика дозволяє не тільки аналізувати ступінь злоякісності процесу, але й проводити ранню ідентифікацію маркерів несприятливого прогнозу щодо перебігу хвороби, здійснювати ранню діагностику рецидивів, великою мірою вилучати фактор суб’єктивності в оцінці конкретного клінічного синдрому, що є вкрай важливим для вибору тактики лікування.

      Дисертаційна робота присвячена дослідженню імунофенотипування бластних клітин, спектра та експресії химерних генів, змін клініко-лабораторних показників у периферійній крові в порівнянні з показниками перебігу ГЛЛ у дітей. Проведена оцінка ролі маркерів молекулярно-генетичної діагностики ГЛЛ у дітей у перебігу захворювання та ефективності цитостатичної терапії ALLIC BFM-2009.

Встановлено, що в патогенезі ГЛЛ ключову роль відіграють генетичні порушення, які призводять до порушення процесів дозрівання і проліферації лімфоцитів, блокування нормальної регуляції функціонування генів. Показано, що визначальну роль у розвитку ГЛЛ відіграють хромосомні транслокації, які призводять до утворення химерних генів, серед яких чільне місце належить генам AF4/MLL t(4;11)(q23;p23), BCR/ABL t(9;22)(q34;q11), E2A/PBX1 t(1;19)(q23;p13), TEL/AML t(12;21)(q13;q22). Продукти експресії цих генів володіють аберантною активністю. Хромосомні перебудови визначають біологічні властивості лейкозних клітин, які обумовлюють імунологічні, морфологічні зміни бластів і клінічні особливості захворювання. У хворих ГЛЛ при цитогенетичному дослідженні клітин кісткового мозку клональні хромосомні перебудови простежували в 34,3 % випадків, тоді як у 65,7 % пацієнтів молекулярно-генетичних змін не було виявлено. У процесі дослідження встановлено, що найчастіше виявлялись химерні гени AF4/MLL (21 %) та TEL/AML (5,7 %), рідше BCR/ABL(2 %). Хоча транслокація BCR/ABL траплялась рідше, проте експресія цього гена була найвищою. Окрім того, при хромосомних транслокаціях BCR/ABL та E2A/PBX1 рівень бластних клітин у кістковому мозку досягав показника вище 95 %.

У дисертаційному дослідженні показано прогностичне значення й терапевтичну стратегію хромосомних порушень під час та після проведення цитостатичної терапії ALLIC BFM-2009, а також при розвитку рецидивів.

У роботі доведено, що наявність морфологічної ремісії у хворих на ГЛЛ не завжди свідчила про повну редукцію пухлинного клону. Молекулярно-генетичні особливості бластних клітин служать основою для різних методів детекції малої кількості пухлинних клітин. До них належать метод стандартної цитогенетики й імунофлюоресцентна гібридизація (моніторинг різних хромосомних аберацій), проточна цитофлуорометрія (виявлення аберантного імунофенотипу), метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (визначення експресії химерних онкогенів). Одним із прогностичних критеріїв розвитку рецидивів при ГЛЛ є виявлення мінімальної резидуальної хвороби (МRD), яку можна контролювати на різних етапах терапії. Моніторинг пухлинних маркерів під час і після хіміотерапії істотно підвищить її ефективність і дозволить передбачити розвиток рецидивів або навіть запобігти їхній появі.

Застосування цитостатичної терапії ALLIC BFM 2009 у 88 % пацієнтів призводило до повної ремісії, а у 12 % дітей виявляли рецидив захворювання. В основі виникнення рецидивів лежить персистенція залишкових лейкемічних клітин. Визначення MRD як незалежного критерію оцінки відповіді організму дитини на терапію в пацієнтів із повною ремісією показало зниження показника в динаміці проведення хіміотерапії з мінімальними значеннями після закінчення курсу. Водночас у пацієнтів із високим рівнем MRD виявлений рецидив захворювання. Окрім того, значення MRD безпосередньо корелювало з виживанням пацієнтів. Так, у пацієнтів із підвищеним рівнем MRD знижувалося безрецидивне та безподійне виживання.

Уперше проведено комплексне вивчення імунофенотипу бластних клітин залежно від розвитку рецидиву та повної ремісії. Дослідження антигенного складу бластних клітин після проведення ALLIC-BFM 2009 цитостатичної терапії в пацієнтів із редидивами показало високий рівень імунофенотипу лінійно-незалежних лімфобластів – експресію СD34, HLA, Auti-TdT, СD10 та СD38. Наявність маркера СD38 не пов’язана з клінічною картиною, що спостерігається при ГЛЛ та не впливає на загальне виживання хворих. У пацієнтів із ГЛЛ виявлена експресія мієлоїдних маркерів CD33 та CD13, наявність яких пов’язуть із виживанням пацієнтів. У роботі показано, що триваліше виживання хворих на ГЛЛ співвідносилось з експресією на бластних клітинах CD13, тоді як експресія CD33 на бластних клітинах свідчила про низьке безрецидивне та безподійне виживання хворих на ГЛЛ.

У роботі підтверджено відому думку про залежність перебігу захворювання від наявності хромосомних транслокацій. Лікування в пацієнтів із транслокаціями та без них не показало змін середнього значення кількості лейкоцитів (становило 3 Г/л), тоді як максимальне значення кількості лейкоцитів у пацієнтів із транслокаціями перебувало на рівні 38 Г/л, а в пацієнтів за умови відсутності транслокацій – на рівні 102 Г/л. Відхилення кількості лейкоцитів від середнього арифметичного пов’язані з видом хромосомної аберації, бо найвище коливання кількості лейкоцитів у крові спостерігалось у пацієнтів із BCR/ABL химерним геном.

Аналіз молекулярно-генетичних показників, одержаних під час виконання дисертаційної роботи, підтверджував залежність розвитку рецидивів від наявності тієї чи іншої хромосомної аберації. З отриманих даних видно, що визначальну роль у розвитку рецидивів ГЛЛ мали досліджувані три хромосомні транслокації відповідних локусів хромосом – AF4/MLL t(4;11)(q23;p23), BCR/ABL t(9;22)(q34;q11), E2A/PBX1 t(1;19)(q23;p13), рівень яких становив 9 %. Ген TEL/AML t(12;21)(q13;q22) у пацієнтів із рецидивами не був ідентифікований.

Клітини лейкемічного клону можуть мати нестабільний геном, у результаті чого в химерних генах AF4/MLL, BCR/ABL та E2A/PBX1 відбуватимуться мутації, які призведуть до зміни конформації онкогенних білків, то в цьому випадку цитостатики втрачають здатність блокувати онкогени та посилену проліферацію клітин, які, у свою чергу, набувають резистентності до хіміопрепаратів.

Молекулярно-генетичне дослідження кісткового мозку пацієнтів із ГЛЛ за допомогою ПЛР у реальному часі показало, що найвища експресія спостерігається в онкогена BCR/AВL, бо виявлено 4,2±0,65х10^-3 копій мРНК відносно контрольного гена AВL1. Встановлений факт вказував, що ген BCR/ABL є ключовим патогенетичним фактором розвитку переважної кількості випадків ГЛЛ у дітей. Після цитостатичної терапії в пацієнтів із виявленими рецидивами захворювання його рівень знижувався незначно – у 2,3 рази, тоді як у пацієнтів із повною ремісією знижувався у 20 разів. Тенденція таких змін впливає на виживання пацієнтів, бо виявлена залежність безрецидивного виживання від наявності певної хромосомної аберації. У роботі показано, що найнижче безрецидивне виживання (найвища летальність) спостерігалось у пацієнтів, у яких виявили транслокацію BCR/ABL, бо через 2 роки після хіміотерапії зафіксована смертність хворих. На другому місці за найнижчим виживанням були пацієнти із виявленим химерним геном AF4/MLL, у яких смертність зафіксована на 4-му році життя. Найвищий показник безрецидивного виживання спостерігався в пацієнтів із наявною в геномі транслокацією TEL/AML (100 % виживання) та в пацієнтів із виявленим химерним геном E2A/PBX1 (безрецидивне виживання перебувало на рівні 80 %). Однак є низка хромосомних аберацій, прогностичне значення яких ще не встановлено.

Отже, у дисертаційній роботі підкреслено важливість цитогенетичного дослідження, бо розуміння молекулярних і генетичних механізмів розвитку ГЛЛ призводить до створення нових диференційованих підходів до лікування конкретного біологічного варіанта ГЛЛ. Крім того, прогрес у терапії ГЛЛ досягається за допомогою впровадження нових препаратів, які безпосередньо діють на гени мішені.

У роботі на основі отриманих даних розширено спектр генетичних критеріїв прогнозування перебігу захворювання ГЛЛ і розвитку рецидивів. Удосконалено оптимальну схему досліджень генетичних порушень у дітей із ГЛЛ.

Ключові слова: гостра лімфобластна лейкемія в дітей, химерні гени AF4/MLL, BCR/ABL, E2A/PBX1, TEL/AML, молекулярно-генетичні зміни, бластні клітини, лейкоцити, транслокація.

ABSTRACT

Vynnytska O. А. Features of mutational status in childhood acute lymphoblastic leukemia. – Qualifying scientific work on the rights of the manuscript.

Dissertation for the degree of Doctor of Philosophy in the specialty 228 -pediatrics (22 – Healthcare). – Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ministry of Health of Ukraine, Lviv, 2022.

Modern molecular genetic diagnosis of acute lymphoblastic leukemia (ALL) is based on the identification of specific genetic disorders that are associated with malignant cell transformation. Genodiagnostics allows not only to analyze the degree of malignancy of the process, but also to conduct early identification of markers of unfavourable prognosis for the course of the disease, to conduct early diagnosis of relapses, largely remove the subjectivity factor in assessing a particular clinical syndrome, which is crucial for treatment tactics.

The dissertation is devoted to the study of blast cell immunophenotyping, spectrum and expression of chimeric genes, changes in clinical and laboratory parameters in peripheral blood in comparison with the indicators of the course of childhood ALL. The role of markers of molecular genetic diagnosis of childhood ALL caused by disease and the effectiveness of cytostatic therapy ALLIC BFM-2009 was evaluated.

It is established that genetic disorders play a key role in the pathogenesis of ALL, which leads to disruption of the processes of maturation and proliferation of lymphocytes, blocking the normal regulation of gene function. It is shown that chromosomal translocations play a key role in the development of ALL, which lead to the formation of chimeric genes, among which the prominent place belongs to the genes AF4/MLL t (4; 11) (q23; p23), BCR/ABL t (9; 22) q34; q11), E2A/PBX1 t (1; 19) (q23; p13), TEL/AML t (12; 21) (q13; q22). The expression products of these genes have aberrant activity. Chromosomal rearrangements determine the biological properties of leukemic cells, which determine the immunological, morphological and clinical features of the disease. In patients with ALL cytogenetic examination of bone marrow cells clonal chromosomal rearrangements are detected in 34,3 % of cases, while in 65,7 % of patients no molecular genetic changes were detected. The study found that the most common are chimeric genes AF4/MLL (21 %) and TEL/AML (5,7 %), less BCR/ABL (2 %). Despite the fact that BCR/ABL translocation is less common, expression of this gene is highest. In addition, in the case of chromosomal translocations BCR/ABL and E2A/PBX1, the level of blast cells in the bone marrow reaches above 95 %.

The dissertation research shows the prognostic value and therapeutic strategy of chromosomal disorders during and after cytostatic therapy ALLIC BFM-2009, as well as in the case of relapse.

Study shows that the presence of morphological remission in patients with ALL does not always indicate a complete reduction of the tumor clone. Molecular genetic features of blast cells underlie various methods of detecting a small number of tumor cells. These include the method of standard cytogenetics and immunofluorescence hybridization (monitoring of various chromosomal aberrations), flow cytofluorometry (detection of aberrant immunophenotype), the method of polymerase chain reaction (PCR) (determination of the expression of chimeric oncogenes). Detection of minimal residual disease (MRD) at different stages of therapy is a favorable prognostic factor for recurrence. Therefore, the use of tumor markers for monitoring significantly increases its reliability and prevents false negative results.

The use of cytostatic therapy ALLIC BFM 2009 in 88 % of patients leads to complete remission, and 12 % of children have a recurrence of the disease. The basis of recurrence is the persistence of residual leukemic cells. The definition of MRD as an independent criterion for assessing the child’s response to therapy in patients with complete remission showed a decrease in the dynamics of chemotherapy with minimal values after the end of chemotherapy. At the same time, in patients who subsequently recurred, MRD remained high, indicating a risk of tumor clone growth. The value of MRD is directly related to patient survival, as increasing MRD reduces the recurrence and eventless survival of patients. A similar pattern is observed with the level of blast cells: in patients in whom the level of blast cells was high during cytostatic therapy, subsequently relapse-free and eventless survival decreased.

For the first time, a comprehensive study of the immunophenotype of blast cells depending on the development of relapses and complete remission was conducted. Study of blast cell antigenic composition after ALLIC-BFM 2009 cytostatic therapy in patients with relapses showed a high level of immunophenotype of linearly independent lymphoblasts – expression of CD34, HLA, Auti-TdT, CD10 and CD38. The presence of the CD38 marker is not related to the clinical picture observed in ALL and does not affect the overall survival of patients. Expression of the myeloid markers CD33 and CD13 has been reported in patients with ALL, which has been linked to patient survival. The longer survival of patients with ALL was shown to correlate with the expression on CD13 blast cells, while the expression of CD33 on blast cells indicates low recurrence-free and eventless survival of patients with ALL.

The study confirms the existing opinion about the dependence of the disease on the presence of chromosomal translocations. Treatment in patients with and without translocations did not show changes in the mean leukocyte count (3g/L), whereas the maximum leukocyte count in patients with translocations was 38 g/L, and in patients without translocations – at levels of 102 g/L. Deviations in the number of leukocytes from the arithmetic mean are associated with the type of chromosomal aberration, as the highest fluctuations in the number of leukocytes in the blood are observed in patients with the BCR / ABL chimeric gene.

Analysis of molecular genetic parameters obtained during the dissertation confirms the dependence of recurrence on the presence of a chromosomal aberration. The obtained data show that the key role in the development of ALL recurrences is played by the three chromosomal translocations of the corresponding chromosome loci studied by us – AF4/MLL t (4; 11) (q23; p23), BCR/ABL t (9; 22) (q34; q11), E2A/PBX1 t (1; 19) (q23; p13), the level of which is 9 %. The TEL/AML t (12; 21) gene (q13; q22) has not been identified in recurred patients.

Because leukemic clone cells may have an unstable genome, resulting in mutations in the chimeric AF4/MLL, BCR/ABL, and E2A/PBX1 genes that alter the conformation of oncogenic proteins, cytostatic loses the ability to block oncogenes and enhance proliferation, which, in turn, become resistant to chemotherapeutics. Molecular genetic study of the bone marrow of patients with ALL by real-time PCR showed that the highest expression is observed in the oncogene BCR/ABL, as found 4.2 ± 0.65x10-3 copies of mRNA relative to the control gene ABL1. The established fact indicates that the BCR/ABL gene is a key pathogenetic factor in the development of the vast majority of cases of childhood ALL. About what after cytostatic therapy at patients with the revealed recurrences of a disease its level decreases insignificantly – in 2,3 times whereas at patients with complete remission decreases in 20 times. The trend of such changes affects the survival of patients, as the dependence of relapse-free survival on the presence of a certain chromosomal aberration. The paper showed that the lowest recurrence-free survival (highest mortality) was observed in patients with BCR/ABL translocation, because 2 years after chemotherapy, mortality was recorded. In second place for the lowest survival were patients with the detected chimeric AF4/MLL gene, in which mortality was recorded in the 4th year of life. The highest rate of recurrence-free survival was observed in patients with genome TEL/AML translocation (100 % survival) and in patients with the detected chimeric E2A/PBX1 gene (recurrence-free survival was 80 %). However, there are a number of chromosomal aberrations, the prognostic value of which is not fully established.

Thus, the dissertation thesis emphasizes the importance of cytogenetic research, as understanding the molecular and genetic mechanisms of ALL development leads to the creation of new differentiated approaches to the treatment of a specific biological variant of ALL. In addition, progress in the treatment of ALL is being achieved through the introduction of new drugs that act directly on the target genes. Based on the obtained data, the range of genetic criteria for predicting the course of ALL disease and predicting the development of recurrence cases is expanded. The optimal scheme of research of genetic disorders among children with ALL has been developed.

Key words: childhood acute lymphoblastic leukemia, chimeric genes AF4/MLL, BCR/ABL, E2A/PBX1, TEL/AML, molecular genetic changes,blast cells, leukocytes, translocation.

ЕЦП:https://drive.google.com/file/d/1N3TXN2AlixLFRwGP12D4_YAUon0qFUs1/view?usp=sharing