ОСОБЛИВОСТІ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНИХ, ІМУННИХ, Са2+ - ТА NO-ЗАЛЕЖНИХ РЕГУЛЯТОРНИХ СИСТЕМ КЛІТИН ТА ЇХ ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК ІЗ МІКРОБІОМОМ ЗА УМОВ РОЗВИТКУ ЧОЛОВІЧОЇ НЕПЛІДНОСТІ ТА СУПУТНЬОЇ АУТОІМУННОЇ ПАТОЛОГІЇ

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія (22 – Охорона здоров’я). Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, Львів, 2024; Тернопільський національний медичний університет ім. І.Я. Гобачевського МОЗ України, Тернопіль, 2024.

Дисертація присвячена вивченню біохімічних механізмів розвитку патоспермії, ідіопатичної неплідності та супутньої аутоімунної патології суглобів за участі антиоксидантної, імунної, NO- та Са2+-АТФ-залежних регуляторних систем, а також мікробіому сечостатевої системи та оцінці прогностичної значущості біохімічних, імунологічних і бактеріологічних маркерів у розвитку цих захворювань. Робота грунтується на аналізі результатів комплексного дослідження зразків сперми та крові 388 пацієнтів чоловічої статі із різними формами непліддя. Залежно від характеру патології (за показниками спермограми, даних анамнезу, інструментальних і лабораторних методів дослідження) чоловіків поділяли на три основні групи: 1-а група – 247 неплідних чоловіків із різними формами патоспермії, 2-а група – 73 чоловіки з ідіопатичним непліддям, 3-я група – 68 неплідних чоловіків у поєднанні з аутоімунною патологією суглобів.

Своєю чергою пацієнти 1-ї групи з патоспермією були поділені на 5 підгруп: олігозооспермія (концентрація сперматозоїдів в еякуляті < 20·106 клітин/мл, n=30), астенозооспермія (рухливість сперматозоїдів < 40 %, n=34),
олігоастеноспермія (поєднана форма патозооспермії, n=22), лейкоцитоспермія (вміст лейкоцитів коливалося від 1,0·106 /мл до 3,0·106 /мл, що свідчило про наявність запального процесу у цих чоловіків, n=42), азоооспермія (n=119) із яких із необструктивною формою (НОА) - 69 та обструктивною формою (ОА) – 50 пацієнтів. Серед 73 неплідних чоловіків із встановленим діагнозом «ідіопатична неплідність» у 42 спостерігалось незначне порушенням параметрів сперми (оліго-, астено-, тератозооспермія), а у 31 - нормозооспермія. У 68 пацієнтів із встановленим діагнозом «ідіопатична неплідність» був одночасно діагностований ревматоїдний артрит. Контрольна група складалась із 56 соматично здорових чоловіків віком від 22 до 45 років (середній вік 32,7±4,3
роки) зі збереженою фертильністю й нормозооспермією та підтвердженим батьківством. Матеріал для дослідження отримували у центральній клінічній лабораторії, урологічному та ревматологічному відділеннях КНП ЛОР «Львівська обласна клінічна лікарня».

Виявлено, що пероксидація ліпідів у сперматозоїдах була підвищеною у чотирьох досліджуваних групах чоловіків із патозооспермією порівняно з аналогічним показником контрольної групи чоловіків. Найбільш виражені зміни у пероксидації ліпідів (ПОЛ) відмічаються в сперматозоїдах неплідних чоловіків із лейкоцитоспермією – в 2,7 раза (p<0,001) щодо величин у сперматозоїдах чоловіків із збереженою фертильністю. Активація процесів ПОЛ в сім’яній плазмі спостерігалась також при необструктивній формі азооспермiї (НОА), де процеси ПОЛ інтенсифiкуються - в 1,6 раза (р<0,05).

Одночасно з інтенсифікацією прoцесів ПОЛ відбуваються відповiдні зміни і в активнoсті ензимів системи антиоксидантного захисту. Встановлено, що GP активність сперматозоїдів чоловіків з олігозооспермією знижується в 2,2 раза (p<0,001) стосовно величин у здорових чоловіків із збереженою фертильністю. У сперматозоїдах чоловіків з астенозооспермією та олігоастенозооспермією активність GP є нижчою 2,8 раза (p<0,01; p<0,001) щодо величин в осіб групи контролю. Та найбільш виражені зміни в активностях GP сперматозоїдів відмічаються в неплідних чоловіків із лейкоцитоспермією – в 3,8 раза (p<0,001) відносно показників контрольної групи.
Активність GR сперматозоїдів при астенозооспермії була нижчою у 1,6 раза (p<0,05) а при олігозооспермії була нижчою у 2,3 раза (р<0,05), ніж у чоловіків зі збереженою фертильністю. За умов поєднаної патології (олігоастенозооспермія) глутатіонредуктазна активність є нижчою в 1,7 раза, ніж у сперматозоїдах чоловіків контрольної групи. Найбільш виражені зміни в активностях GR сперматозоїдів відмічаються в неплідних чоловіків з лейкоцитоспермією – в 3,3 раза (p<0,01) відносно величин у чоловіків із збереженою фертильністю (нормозооспермія). При необструктивній формі азооспермії активність GR була в 1,3 нижчою щодо контрольних значень (р<0,05). Активність GsT сперматозоїдів при олігозооспермії була нижчою у 1,7 раза (p<0,05), ніж в здорових чоловіків зі збереженою фертильністю. У сперматозоїдах чоловіків з астено- та олігоастенозооспермією активність GsT була нижчою вдвічі (p<0,05; p<0,01) щодо величин у чоловіків з нормозооспермією. В сперматозоїдах чоловіків з лейкоцитоспермією GsT активність була найбільш пригніченою – в 5 разів (p<0,001) відносно контрольних показників. При необструктивнiй формі азооспермії в сім’яній плазмі активність глутатіонтрансферази достовiрно знижується, в 1,2 раза (р<0,05) в порівнянні з контрольною групою.

Виявлено зниження рівня загального (GSHt) та відновленого глутатіону (GSH) в сперматозоїдів неплідних чоловіків з різними формами патоспермії. Зокрема, у сперматозоїдах чоловіків із олігозооспермією вміст GSHt був нижчим в 1,9 раза (p<0,01) відносно показника при нормозооспермії. В зразках сперми чоловіків із астено- та астенозооспермією вміст GSHt був нижчим в 1,8 і 1,7 раза (p<0,01; p<0,05) відповідно щодо показника контрольної групи. У сперматозоїдах інфертильних чоловіків із лейкоцитоспермією вміст GSHt був в 1,2 рази нижчим відносно фертильних чоловіків, проте ці зміни не були статистично достовірними. Вміст GSH у сперматозоїдах чоловіків з олігозооспермією був вдвічі нижчим (p<0,01) стосовно цього показника у фертильних чоловіків. У пацієнтів з астенозооспермією та олігоастенозооспермією вміст GSH у сперматозоїдах був нижчим в 1,9 рази (p<0,01; p<0,05) відносно чоловіків із нормозооспермією. Найнижчі зміни у величині GSH виявлено в інфертильних чоловіків з лейкоцитоспериією – в 1,3 рази нижче, ніж у чоловіків з нормозооспермією, проте ці зміни не були статистично достовірними. Обчислення RІ GSH продемонструвало зниження сумарної потужності глутатіонової антиоксидантної системи у сперматозоїдах інфертильних чоловіків. Найбільш виражене зниження RІ GSH характерне щодо астено- та олігоастенозооспермії. Проте, у сперматозоїдах інфертильних чоловіків із лейкоцитоспермією, показник RІ GSH достовірно не відрізнявся від такого у сперматозоїдах фертильних чоловіків. За ступенем зниження індекса антиоксидантного статусу сперматозоїдів неплідних чоловіків виявлено наступну патологічну асоційовану (патозооспермія) послідовність (a disorder-associated trend): олігозооспермія > олігоастенозооспермія ≈ астенозооспермія >> лейкоцитоспермія. Встановлено, що рівні GSH у сім’яній плазмі позитивно корелюють з концентрацією сперматозоїдів (r = 0,73), рухливістю сперматозоїдів (r = 0,70) та нормальною морфологією сперматозоїдів (r = 0,72). Виявлено негативний кореляційний зв’язок між рівнями MДA та GSH у сім’яній плазмі (r = -0,57), що свідчить про зростання пероксидації ліпідів на фоні зниження концентрації відновленого глутатіону.

Досліджена система антиоксидантного захисту при ідіопатичному неплідді та неплідних чоловіків у поєднанні з аутоімунною патологією суглобів. Виявлено, що у сироватці крові неплідних чоловіків вміст МДА був вірогідно
вищим у всіх обстежених досліджуваних групах щодо контрольних значень. При цьому у пацієнтів із ідіопатичним непліддям він перевищував показники контрольної групи у 2,16 раза (р<0,001), а у неплідних чоловіків у поєднанні з аутоімунною патологією суглобів – у 2,25 раза (р<0,001). При цьому загальна антиоксидантна активність знижувалась в 1,9 раза. При аналізі сім’яної рідини було виявлено, що вміст МДА в ній у чоловіків із непліддям на ґрунті аутоімунної патології вірогідно перевищує контрольні значення у 4 раза.
Наявність оберненого статистично достовірного кореляційного зв’язку між вмістом МДА у сім’яній рідині і рухливістю сперматозоїдів (r =-0,66; р<0,05) засвідчує важливість інтенсифікації пероксидного окиснення ліпідів у зниженні рухливості сперматозоїдів. Встановлена наявність прямого кореляційного зв’язку між загальною антиоксидантною активністю та рухливістю сперматозоїдів (r = 0,62; р<0,05), що вказує на вагому роль захисних ресурсів системи антиокисидантного захисту у збереженні рухливості сперматозоїдів. Таким чином, отримані дані свідчать про те, що оксидативний стрес є одним із імунопатогенетичних механізмів розвитку патоспермії та непліддя на тлі аутоімунної патології суглобів.

В регуляції практично всіх внутрішньоклітинних процесів бере участь вторинний месенджер – Нітрогену оксид (NO), як один із продуктів аргіназної реакції. Встановлено, що активність аргінази в сперматозоїдах неплідних чоловіків з олігозооспермією в 2,1 раза нижча (p<0,001), ніж при нормозооспермії, а у чоловіків із порушеним сперматогенезом за типом астенозооспермії активність аргінази вірогідно нижча в 2,3 раза (p<0,001). У разі поєднаної патології сперматогенезу (олігоастенозооспермія) аргіназна активність сперматозоїдів є дещо нижчою, ніж при окремих порушеннях сперматогенезу та в 2,4 раза (p<0,001) нижча, ніж у фертильних чоловіків. За наявності лейкоцитоспермії цей показник був нижчим в 3,3 раза (p<0,001) щодо значень у фертильних чоловіків. При НОА в сім’яній плазмі аргіназна активнiсть була в 1,5 раза нижчою (p<0,05), а в сироватці крові в 1,3 раза нижчою ніж в контролі (p<0,05).
У лімфоцитах крові неплідних чоловіків із супутньою аутоімунною патологією суглобів (РА) відмічалось зростання активності аргінази в 2,75 раза щодо котрольних значень (p<0,001). Сперматозоїди неплідних чоловіків всіх досліджуваних груп порівняно з чоловіками групи контролю характеризувалися зниженою активністю конститутивної ізоформи NO-синтази (сNOS). Так, активність сNOS сперматозоїдів чоловіків з оліго- та олігоастенозооспермією була в 1,5 раза (р<0,05), а у чоловіків з астенозооспермією – в 1,4 раза (р<0,05)
нижчою порівняно з її величинами у сперматозоїдах фертильних чоловіків. Максимальне пригнічення активності сNOS відмічалось у сперматозоїдах чоловіків з лейкоцитоспермією – в 3,2 рази (p<0,001) порівняно з фертильними чоловіками.
У сперматозоїдах інфертильних чоловіків активність iNOS була підвищенною у 22,9–56,0 раза у всіх досліджуваних групах. Хоча у сперматозоїдах чоловіків із лейкоцитоспермією встановлено найбільшу активність iNOS, яка перевищувала контрольні значення у фертильних чоловіків у 56 раза (р<0,001). Зокрема, активність iNOS в сперматозоїдах від чоловіків з олігозооспермією була вищою в 22,9 (p<0,001), а в сперматозоїдах чоловіків з астено- і олігоастенозооспермією – в 30 разів вищою порівняно з активністю iNOS у сперматозоїдах фертильних чоловіків (p<0,001). Співвідношення активностей iNOS/cNOS було достовірно вищим у сперматозоїдах чоловіків з олігозоо-, астенозоо-, олігоастенозооспермією і чоловіків із лейкоцитоспермією порівняно з чоловіками контрольної групи. Активність сNOS у досліджуваних зразках сперматозоїдів від чоловіків із НОА достовiрно не змiнюється щодо контролю, однак активнiсть iNOS, яка є Са2+ -незалежною, зростає щодо контролю в 17,7 раза. Зростання вказаних співвідношень у сперматозоїдах інфертильних чоловіків всіх досліджуваних груп свідчить про активацію iNOS, що викликана у відповідь на дію бактеріальних ендотоксинів і запальних цитокінів і є вагомим патогенетичним маркером, що приймає участь у формуванні незворотних уражень і може бути додатковим тестом на патоспермію. Також, продемонстровано співвідношення аргінази до іNOS, за нормозооспермiї воно складає 11,9, а за НОА – 0,5. Таким чином, співідношення в сім’яній плазмі показників аргiназа/іNOS може бути використаний як додатковий критерій розвитку необструктивної форми азооспермiї. Важливo відмiтити, що при азооспермії суттєво зростає спiввiдношення NO3 - /NO2 -, у 4,9 раза. В той час як у нoрмі це співвіднoшення дорiвнює 2,0 раза.

У неплідних чоловіків із ревматоїдним артритом активність сNOS лімфоцитів крові статистично достовірно знижувалась в 2,1 раза (p<0,001), у той же час активність іNOS зростала в 75 разів (p<0,001). Ензиматичний аналіз виявив значну різницю в активності сумарної NOS (та її окремих ізоформ) і аргінази у сперматозоїдах чоловіків з нормо- і патозооспермією. Показано, що сумарна активність NOS у сперматозоїдах чоловіків з олігозооспермією була в 1,9 рази (p<0,001) вищою, ніж у чоловіків із нормозооспермією. В зразках від чоловіків з астенозооспермією та олігоастенозооспермією сумарна активність NOS була в 2,3 рази (p<0,001) вища, ніж у контрольних зразках. Найбільш виражені зміни в активності сумарної NOS спостерігалися у пацієнтів з лейкоцитоспермією – в 3,4 рази (p<0,001) більше, ніж у чоловіків з нормозооспермією. Водночас, спостерігалося пригнічення активності аргінази в сперматозоїдах чоловіків з патозооспермією порівняно з контрольною групою. У пацієнтів з оліго-, астено- та олігоастененозооспермією активність Na+,K+ -ATФази була нижчою вдвічі (p<0,01; p<0,001) порівняно з контрольною групою. У пацієнтів з лейкоцитоспермією активність Na+,K+-ATФази була нижча в 1,5 рази (p<0,05) стосовно цього показника у сперматозоїдах чоловіків з нормозооспермією. У неплідних чоловіків у поєднанні з аутоімунною патологією суглобів Na+ ,K+ -ATФазна активність лімфоцитів крові статистично достовірно знижувалась в 1,7 раза (p<0,05). У пацієнтів з астено- та
олігоастенозооспермією активність тапсигаргін-чутливої компоненти Ca2+,Mg2+ - ATФази була статистично вірогідно нижчою щодо величин у здорових чоловіків із збереженою фертильністю в 2,3- і 2,6 раза відповідно (p<0,001). У сперматозоїдах чоловіків із лейкоцитоспермією відмічалось зниження тапсигаргін-чутливої Ca2+,Mg2+-ATФази в 3,8 раза щодо величин у сперматозоїдах при нормозооспермії. У пацієнтів з астено- та
олігоастенозооспермією тапсигаргін-резистентна компонента Ca2+,Mg2+ -ATФази була нижчою в 2,6-2,7 раза порівняно з показниками при нормозооспермії (p<0,001). Найбільш виражене пригніченя активності Ca2+,Mg2+ -ATФази плазматичної мембрани відмічалось у сперматозоїдах пацієнтів з лейкоцитоспермією – в 4,2 рази (p<0,05) щодо величин у сперматозоїдах фертильних чоловіків. внутрішньоклітинних Ca2+ -депо. При НОА активнiсть цього ензиму знижувалась в 1,5 раза (p<0,05). Пригнічення активностей
Ca2+,Mg2+-ATФаз призводить до сповільнення відтоку Са2+ з цитозоля і призводить до його перевантаження йонами кальцію, які у високих концентраціях є шкідливими для клітини. У неплідних чоловіків супутньою
аутоімунною патологією суглобів Са2+,Mg2+-ATФазна активність плазматичної мембрани і мембран ендоплазматичного ретикулуму лімфоцитів крові теж статистично достовірно знижувалась щодо контрольної групи.
Для з’ясування імунопатогенетичних механізмів розвитку непліддя потрібні також дослідження кількості лімфоцитів різних популяцій, субпопуляцій та їх активаційного статусу. Активаційний статус лімфоцитів залежить від функціональної здатності активаційних маркерів, що розміщенні на їх поверхні, зокрема CD25, CD95, CD3. У чоловіків з оліго- та астено-олігоастенозооспермією спостерігався достовірно підвищений рівень CD4+CD25+ у спермі в 1,3 рази відносно контрольної групи, що свідчить про посилену активність протиінфекційного імунітету. У чоловіків з ідіопатичним непліддям у крові виявлено вірогідне збільшення CD4+CD25+ Т-лімфоцитів в 1,4 раза (р<0,05). При неплідді, що супроводжується аутоімунною патологією суглобів достовірних змін кількості CD4+CD25+ Т-лімфоцитів не виявлено. Показано, що неплідних чоловіків із ревматоїдним артритом відрізняють від контролю збільшені показники CD8+ клітин та активованих Т-лімфоцитів. Найбільше відхилень від контролю зареєстровано у осіб з ідіопатичним непліддям: знижена кількість наївних CD4+CD25- лімфоцитів при одночасному підвищенні кількості CD4+CD25+ - регуляторних Т-клітин, що вказує на конверсію наївних Т-лімфоцитів на регуляторні клітини. Проте перебудова імунної системи в умовах розвитку непліддя може проявлятися змінами не тільки середніх значень окремих показників імунної реактивності, але і їх кореляційних
взаємозв'язків. Встановлені нами взаємозв’язки між деякими показниками свідчать про те, що зміна одного із них у парі призводить до відповідної перебудови значення іншого показника імунітету. Це може також свідчити про розбалансованість імунної системи. Припускається можливість використовувати кількісний показник циркулюючих CD4+CD25+ - Т-клітин у неплідних чоловіків з аутоімунною патологією для прогнозування патологічних змін у спермограмі.
Інтеграція клітин між імунною та репродуктивною системою є основою нормальної чоловічої репродукції. У той же час імунологічні реакції, що відбуваються через цитокіни носять подвійний характер для чоловічої
фертильності. Моніторинг цитокінів у сім’яній рідині та сироватці крові з метою з’ясування їх ролі в сперматогенезі може дати можливість краще зрозуміти механізми що призводять до неплідності. Були виявлені кількісні та якісні зміни в спермограмі як при ідіопатичному неплідді, так і при неплідді із аутоімунною патологією суглобів. Концентрація ІL-18 (цитокін родини ІL-1) у сироватці крові неплідних чоловіків з ревматоїдним артритом перевищувала в середньому в 1,4 раза показники фертильних чоловіків, рівень ІL-6 був вищим в 7,0 раза, а показник концентрації ІFN-γ перевищував норму більше, ніж утричі. Суттєві зміни цитокінового профілю сироватки крові були зафіксовані у чоловіків з діагностованим ідіопатичним непліддям. Статистично вірогідно зростав рівень прозапальних цитокінів: ІL-18 – у 3,0 раза, ІL-6 – у 3,2 раза, ІFN-γ – у 2,7 раза. Паралельно збільшувалася концентрація протизапальних: ІL-10 – у 3,1 раза, ТGF-β1 – у 1,1 раза. У неплідних чоловіків із аутоімунною патологією суглобів була зменшена концентрація ТNF-β1 щодо контрольної групи, що могло сприяти посиленню запального процесу. Одночасно, збільшувалися рівень такого прозапального цитокіну, як ІL-18 – у середньому в 2,5 раза. Зареєстровано також зменшення вмісту ІL-1β – у 1,7 раза.

У неплідних чоловіків із аутоімунною патологією суглобів, кореляційної залежності між цитокінами різної спрямованості взагалі не простежувалося, що може свідчити про розбалансованість у формуванні адекватної імунної відповіді. Продемонстровано, що підвищений рівень ІL-18 у сім'яній рідині при ідіопатичному неплідді корелює із зниженням рухливості сперматозоїдів.

При аналізі пацієнтів щодо етіологічного фактора, що спричиняє азооспермію, виявлено, що найбільший відсоток захворювання спричиняє Chlamidia spp.. Однак, при НОА частота виявлення Chlamidia trachomatis складала 3,3 %, а при ОА - 2,9 %. Mycoplasma hominis при НОА виявляли в 5,7 %, а при ОА – в 2,9 %. Ureaplasma urealyticum була діагностована в 12,3 % при НОА і в 11,7 % при ОА, а Ureaplasma рarvum у 13,1 % при НОА та 19,1 % при ОА. При НОА Neisseria gonorrhoeae виявлялась в 6,6 %, а при ОА – в 13,2 %. Herpes simplex virus 2-типу відмічали в 5,7 % чоловіків із НОА і в 7,3 % чоловіків із ОА. Gardnerella spp. діагностували в 9,0 % чоловіків з НОА і в 13,3 % чоловіків з ОА. Частота виявлення Enterococcus faecalis у чоловіків з азооспермією при ОА складає 32,3 %, що майже у два рази вище ніж при НОА (17,2 %). Інфікування еякулята/секрета простати кишковою паличкою при НОА виявлено в 13,1 %, а при ОА – у 23,5 %. Staphylococcus aureus виявлений тільки при ОА (4,4 %). Streptococcus pyogenes виявлений як при НОА (7,4 %), так і при ОА (13,2 %). Streptococcus agalactiae виявлений тільки при ОА – 4,4 %. Klebsiella spp. виявлена в 0,8 % пацієнтів із НОА та в 1,5 % пацієнтів з ОА. Виявлено, що найбільший відсоток захворювання аутоімунної патології суглобів був
спричинений Chlamidia trachomatis (36 %), Streptococcus pyogenes – 19 %, Chlamidia trachomatis і Ureaplasma urealiticus – 5 %. Слід відмітити, що інфекція, спричинена Ureaplasma urealyticum, - найбільш небезпечна для
репродуктивної функції чоловіків. В наших дослідження виявлено найбільший відсоток цього збудника серед інших мікроорганізмів, при НОА – 12,3 %, а при ОА – 11,7 %. Цей збудник змінює різні характеристики процесу сперматогенезу, зокрема сперматогенного епітелію та сперматозоїдів. Таким чином, в рeзультаті проведених досліджень виявлено, що при різних типах патосперомії чоловіків, ідіопатичній неплідності та неплідді у поєднанні з ревматоїдним артритом відбуваються біохімічні та імунні зміни не тільки в сім’яній плазмі та сперматозоїдах, але й у сироватці крові і лімфоцитах. Особливо ці зміни проявляються в порушенні рeгуляторних систем клітини – про- та антиоксидантної, аргіназо-NO-синтазної та Са2+ -АТФ-залежної. Суттєві
зміни відбуваються в співвідношенні супопуляцій лімфоцитів, у зростанні концентрації прозапальних цитокінів і наявності патогенної урогенітальної мікрофлори. Важливими додатковими прогностичними показниками неплідності можуть бути зростання в сім’яній плазмі активності індуцибельної ізоформи NO-синтази, співвідношення відновлeного глутатіону до окисненого, редокс-індекс відновленого глутатіону, співвідношення активності аргінази до індуцибельної ізоформи NO-синтази, а також співвідношення мeтаболітів оксиду азоту – NO3 - /NO2 -.

Ключові слова: неплідність чоловіків, ідіопатична неплідність, патоспермія, аутоімунні захворювання суглобів, сперматозоїди, сім’яна плазма, лімфоцити, cироватка крові, оксидативний стрес, антиоксидантний захист,
АТФази, NO-синтази, оксид азоту, інтерлейкіни, мікробіота.

SUMMARY

Melnyk O.V. Peculiarities of free-radical, immune, Ca2+- and NO-dependent regulatory systems of cells and their relationship with the microbiome under conditions of development of male infertility and concomitant autoimmune pathology. Qualifying scientific work on manuscript rights.

Dissertation for obtaining the scientific degree of Doctor of Medical Sciences in the specialty 03.00.04 - biochemistry (22 - Health care). Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ministry of Health of Ukraine, Lviv, 2024; I. Hobachevsky Ternopil National Medical University, Ministry of Health of Ukraine, Ternopil, 2024.

The dissertation is devoted to the study of the biochemical mechanisms of the development of pathospermia, idiopathic infertility and concomitant autoimmune pathology of the joints with the participation of antioxidant, immune, NO- and Ca2+- ATP-dependent regulatory systems, as well as the microbiome of the genitourinary system and the assessment of the prognostic significance of biochemical, immunological and bacteriological markers in the development of these diseases.
The work is based on the analysis of the results of a comprehensive study of sperm and blood samples of 388 male patients with various forms of infertility. Depending on the nature of the pathology (according to spermogram indicators, anamnesis data, instrumental and laboratory research methods), men were divided into three main groups: 1st group – 247 infertile men with various forms of pathospermia, 2nd group – 73 men with idiopathic infertility, the 3rd group – 68 infertile men combined with autoimmune pathology of the joints. In turn, the patients of the 1st group with pathospermia were divided into 5 subgroups: oligozoospermia (sperm concentration in the ejaculate < 20·106 cells/ml, n=30), asthenozoospermia (sperm motility < 40%, n=34), oligoasthenospermia (combined a form of pathozoospermia, n=22), leukocytospermia (the content of leukocytes varied from 1.0·106 /ml to 3.0·106 /ml, which indicated the presence of an inflammatory process in these men, n=42), azoospermia (n=119 ) of which there were 69 patients with a non-obstructive form (NOA) and 50 patients with an obstructive form (OA). Among 73 infertile men with a diagnosis of "idiopathic infertility", 42 had a minor violation of sperm parameters (oligo-, astheno-, teratozoospermia), and 31 had normozoospermia. Rheumatoid arthritis was also diagnosed in 68 patients with a diagnosis of "idiopathic infertility". The control group consisted of 56 somatically healthy men aged 22 to 45 years (mean age 32.7±4.3 years) with preserved fertility and normozoospermia and confirmed paternity. The material for the study was obtained from the central clinical laboratory, urological and rheumatology departments of Lviv Regional Clinical Hospital.
It was found that lipid peroxidation in spermatozoa was increased in four studied groups of men with pathozoospermia compared to a similar indicator of the control group of men. The most pronounced changes in lipid peroxidation (POL) are noted in the spermatozoa of infertile men with leukocytospermia - 2.7 times (p<0.001) compared to the values in the spermatozoa of men with preserved fertility. Activation of LPO processes in seminal plasma was also observed in the non-obstructive form of azoospermia (NOA), where LPO processes are intensified - 1.6 times (р<0.05). Simultaneously with the intensification of LPO processes, there are corresponding changes in the activity of enzymes of the antioxidant defense system. It was established that the GP activity of spermatozoa of men with oligozoospermia is reduced by 2.2 times (p<0.001) in relation to the values of healthy men with preserved fertility. In the spermatozoa of men with asthenozoospermia and oligoasthenozoospermia, GP activity is 2.8 times lower (p <0.01; p<0.001) compared to the values in the control group. And the most pronounced changes in GP sperm activity are noted in infertile men with leukocytospermia - 3.8 times (p<0.001) compared to the indicators of the control group.
GR activity of spermatozoa in asthenozoospermia was 1.6 times lower (p<0.05) and in oligozoospermia it was 2.3 times lower (p<0.05) than in men with preserved fertility. Under conditions of combined pathology (oligoasthenozoospermia), glutathione reductase activity is 1.7 times lower than in the spermatozoa of men of the
control group. The most pronounced changes in the activities of GR spermatozoa are noted in infertile men with leukocytospermia - 3.3 times (p<0.01) relative to the values in men with preserved fertility (normozoospermia). In the non-obstructive form of azoospermia, GR activity was 1.3 times lower than control values (p<0.05). GsT activity of spermatozoa in oligozoospermia was 1.7 times lower (p<0.05) than in healthy men with preserved fertility. In spermatozoa of men with asthenospermia and oligoasthenozoospermia, GsT activity was lower by half (p <0.05; p<0.01) compared to the values in men with normozoospermia. In the spermatozoa of men with leukocytospermia, GsT activity was the most suppressed - 5 times (p<0.001) compared to the control parameters. In the non-obstructive form of azoospermia, glutathione transferase activity in the seminal plasma is significantly reduced, by 1.2 times
(p<0.05) compared to the control group.
A decrease in the level of total (GSHt) and reduced glutathione (GSH) was detected in the spermatozoa of infertile men with various forms of pathospermia. In particular, in the spermatozoa of men with oligozoospermia, the content of GSHt was 1.9 times lower (p<0.01) compared to the indicator with normozoospermia. In the sperm samples of men with astheno- and asthenozoospermia, the content of GSHt was 1.8 and 1.7 times lower (p <0.01; p<0.05), respectively, compared to the indicator of the control group. In spermatozoa of infertile men with leukocytospermia, the content of GSHt was 1.2 times lower than that of fertile men, however, these changes were not statistically significant. The content of GSH in the spermatozoa of men with oligozoospermia was twice lower (p<0.01) compared to this indicator in fertile men. In patients with asthenozoospermia and oligoasthenozoospermia, the content of GSH
in sperm was 1.9 times lower (p<0.01; p<0.05) compared to men with normozoospermia. The lowest changes in the value of GSH were found in infertile men with leukocytospermia - 1.3 times lower than in men with normozoospermia, however, these changes were not statistically significant. The calculation of RI and GSH demonstrated a decrease in the total capacity of the glutathione antioxidant system in the spermatozoa of infertile men. The most pronounced decrease in RI and GSH is characteristic of astheno- and oligoasthenozoospermia. However, in spermatozoa of infertile men with leukocytospermia, the index of RI GSH was not significantly different from that in spermatozoa of fertile men. According to the degree of decrease in the index of the antioxidant status of the spermatozoa of infertile men, the following pathologically associated (pathozoospermia) sequence was revealed (a disorder- associated trend): oligozoospermia > oligoasthenozoospermia ≈ asthenozoospermia >> leukocytospermia. Seminal plasma GSH levels were found to be positively correlated with sperm concentration (r = 0.73), sperm motility (r = 0.70) and normal sperm morphology (r = 0.72). A negative correlation between MDA and GSH levels in
seminal plasma was revealed (r = -0.57), which indicates an increase in lipid peroxidation against the background of a decrease in the concentration of reduced glutathione.
The system of antioxidant defense in idiopathic infertility and infertile men in combination with autoimmune joint pathology was investigated. It was found that in the blood serum of infertile men, the content of MDA was probably higher in all examined research groups compared to control values. At the same time, in patients with idiopathic infertility, it exceeded the indicators of the control group by 2.16 times (p<0.001), and in infertile men in combination with autoimmune pathology of the joints - by 2.25 times (p<0.001). At the same time, the total antioxidant activity decreased by 1.9 times. When analyzing the seminal fluid, it was found that the MDA content in it in men with infertility due to autoimmune pathology probably exceeds the control values by 4 times. The presence of an inverse statistically significant correlation between the content of MDA in seminal fluid and sperm motility (r =-0.66; p<0.05)
proves the importance of intensification of lipid peroxidation in reducing sperm motility. A direct correlation between total antioxidant activity and sperm motility was established (r = 0.62; p<0.05), which indicates the important role of the protective resources of the antioxidant defense system in maintaining sperm motility. Thus, the obtained data indicate that oxidative stress is one of the immunopathogenetic mechanisms of the development of pathospermia and infertility against the background of autoimmune pathology of the joints.
The secondary messenger - Nitric oxide (NO), as one of the products of the arginase reaction, is involved in the regulation of almost all intracellular processes. It was established that the activity of arginase in the spermatozoa of infertile men with oligozoospermia is 2.1 times lower (p<0.001) than with normozoospermia, and in men with impaired spermatogenesis by the type of asthenozoospermia, arginase activity is probably 2.3 times lower (p<0.001) . In the case of a combined pathology of spermatogenesis (oligoasthenozoospermia), arginase activity of spermatozoa is slightly lower than in separate disorders of spermatogenesis and 2.4 times (p<0.001) lower than in fertile men. In the presence of leukocytospermia, this indicator was 3.3 times lower (p<0.001) compared to values in fertile men. With NOA, arginase activity in seminal plasma was 1.5 times lower (p<0.05), and in blood serum 1.3 times lower
than in controls (p<0.05).
In the blood lymphocytes of infertile men with concomitant autoimmune pathology of the joints (RA), a 2.75-fold increase in arginase activity compared to control values was noted (p<0.001). The spermatozoa of infertile men of all studied groups compared to men of the control group were characterized by reduced activity of the constitutive isoform of NO-synthase (cNOS). cNOS activity in spermatozoa of men with oligo- and oligoasthenozoospermia was 1.5 times (p<0.05), and in men with asthenozoospermia – 1.4 times (p<0.05) lower compared to its values in spermatozoa of fertile men . The maximum inhibition of cNOS activity was observed in spermatozoa
of men with leukocytospermia - 3.2 times (p<0.001) compared to fertile men. In the spermatozoa of infertile men, iNOS activity was increased by 22.9–56.0 times in all studied groups. Although the highest iNOS activity was found in the spermatozoa of men with leukocytospermia, which exceeded control values in fertile men by 56 times (p<0.001). In particular, iNOS activity in spermatozoa from men with oligozoospermia was 22.9 times higher (p<0.001), and in spermatozoa from men with astheno- and oligoasthenozoospermia - 30 times higher compared to iNOS activity in spermatozoa of fertile men (p<0.001). The ratio of iNOS/cNOS activities was significantly higher in the spermatozoa of men with oligozoo-, asthenozoo-, oligoasthenozoospermia and men with leukocytospermia compared to men of the control group. The activity of cNOS in the studied sperm samples from men with NOA
does not change significantly compared to the control, but the activity of iNOS, which is Ca2+-independent, increases by 17.7 times compared to the control. The increase in the indicated ratios in the spermatozoa of infertile men of all studied groups indicates the activation of iNOS, which is caused in response to the action of bacterial endotoxins and inflammatory cytokines and is a significant pathogenetic marker that participates
in the formation of irreversible lesions and can be an additional test for pathospermia. Also, the ratio of arginase to iNOS was demonstrated, for normozoospermia it is 11.9, and for NOA - 0.5. Thus, the ratio of arginase/iNOS indicators in seminal plasma can be used as an additional criterion for the development of a non-obstructive form of azoospermia. It is important to note that with azoospermia, the NO3 -/NO2-ratio increases significantly, by 4.9 times. While in the norm this ratio is equal to 2.0 times. In infertile men with rheumatoid arthritis, cNOS activity of blood lymphocytes was statistically significantly reduced by 2.1 times (p<0.001), while iNOS activity increased by 75 times (p<0.001). Enzymatic analysis revealed a significant difference in the activity of total NOS (and its individual isoforms) and arginase in the spermatozoa of men with normo- and pathozoospermia. It was shown that the total
activity of NOS in the spermatozoa of men with oligozoospermia was 1.9 times (p<0.001) higher than in men with normozoospermia. In samples from men with asthenozoospermia and oligoasthenozoospermia, total NOS activity was 2.3 times (p<0.001) higher than in control samples. The most pronounced changes in total NOS activity were observed in patients with leukocytospermia - 3.4 times (p<0.001) more than in men with normozoospermia. At the same time, inhibition of arginase activity was observed in the spermatozoa of men with pathozoospermia compared to the control group. In patients with oligo-, astheno- and oligoasthenenozoospermia, the activity of
Na+,K+-ATPase was lower by half (p<0.01; p<0.001) compared to the control group. In patients with leukocytospermia, the activity of Na+,K+-ATPase was 1.5 times lower (p<0.05) compared to this indicator in the spermatozoa of men with normozoospermia. In infertile men combined with autoimmune joint pathology, the Na+
,K+-ATPase activity of blood lymphocytes was statistically significantly reduced by 1.7 times (p<0.05). In patients with astheno- and oligoasthenozoospermia, the activity of the thapsigargin-sensitive component of Ca2+,Mg2+-ATPase was statistically significantly lower than the values in healthy men with preserved fertility by 2.3- and 2.6-fold, respectively (p<0.001). In the spermatozoa of men with leukocytospermia, a 3.8-fold decrease in thapsigargin-sensitive Ca2+,Mg2+-ATPase was noted compared to the values in spermatozoa with normozoospermia. In patients with asthenospermia and oligoasthenozoospermia, the thapsigargin-resistant component of Ca2+, Mg2+-ATPase was 2.6-2.7 times lower compared to indicators in normozoospermia (p<0.001). The most pronounced
inhibition of Ca2+,Mg2+-ATPase activity of the plasma membrane was noted in the spermatozoa of patients with leukocytospermia - 4.2 times (p<0.05) compared to the values in the spermatozoa of fertile men. With NOA, the activity of this enzyme decreased by 1.5 times (p<0.05). Suppression of Ca2+ , Mg2+ -ATPase activity slows
down Ca2+ outflow from the cytosol and leads to its overload with calcium ions, which in high concentrations are harmful to the cell. In infertile men with concomitant autoimmune pathology of the joints Ca2+,Mg2+-ATPase activity of the plasma membrane and membranes of the endoplasmic reticulum of blood lymphocytes was
also statistically significantly reduced compared to the control group. To find out the immunopathogenetic mechanisms of infertility development, it is also necessary to study the number of lymphocytes of different populations, subpopulations and their activation status. The activation status of lymphocytes depends on the functional capacity of activation markers placed on their surface, in particular CD25, CD95, CD3. In men with oligo- and asthenoligoasthenozoospermia, a significantly increased level of CD4+CD25+ in sperm was observed by 1.3 times compared to the control group, which indicates enhanced activity of anti-infective immunity. In men with idiopathic infertility, a 1.4-fold increase in CD4+CD25+ T- lymphocytes was found in the blood (p<0.05). In infertility accompanied by autoimmune pathology of the joints, no significant changes in the number of CD4+CD25+ T-lymphocytes were detected. It has been shown that infertile men with rheumatoid arthritis are distinguished from controls by increased numbers of CD8+ cells and activated T-lymphocytes. The most deviations from the control were registered in persons with idiopathic infertility: a reduced number of naive CD4+CD25- lymphocytes with a simultaneous increase in the number of CD4+CD25+ - regulatory T cells, which indicates the conversion of naive T-lymphocytes into regulatory cells. However, the restructuring of the immune system in the context of infertility can be manifested by changes not only in the average values of individual indicators of immune reactivity, but also in their correlational relationships. The interrelationships established by us between some indicators indicate that a change in one of them in a pair leads to a corresponding restructuring of the value of another indicator of immunity. It can also indicate an imbalanced immune system. It is possible to use the quantitative index of circulating CD4+CD25+ T-cells in infertile men with autoimmune pathology to predict pathological changes in the spermogram. The integration of cells between the immune and reproductive systems is the basis of normal male reproduction. At the same time, immunological reactions occurring through cytokines have a double character for male fertility. Monitoring cytokines in seminal fluid and blood serum in order to elucidate their role in spermatogenesis may provide an opportunity to better understand the mechanisms leading to infertility. Quantitative and qualitative changes in the sperm count were found both in idiopathic infertility and in infertility with autoimmune joint pathology. The concentration of IL-18 (a cytokine of the IL-1 family) in the blood serum of infertile men with rheumatoid arthritis was on average 1.4 times higher than that of fertile men, the level of IL-6 was 7.0 times higher, and the concentration of IFN-γ exceeded more than three times the norm. Significant changes in the serum cytokine profile were recorded in men diagnosed with idiopathic infertility. The level of pro-inflammatory cytokines increased statistically significantly: IL-18 – 3.0 times, IL-6 – 3.2 times, IFN-γ – 2.7 times. In parallel, the concentration of anti-inflammatory substances increased: IL-10 – 3.1 times, TGF-β1 – 1.1 times. In infertile men with autoimmune joint pathology, the concentration of TNF-β1 was reduced compared to
the control group, which could contribute to an increase in the inflammatory process. At the same time, the level of such a pro-inflammatory cytokine as IL-18 increased by an average of 2.5 times. A 1.7-fold decrease in IL-1β content was also recorded. In infertile men with autoimmune pathology of the joints, there was no correlation
between cytokines of different orientations at all, which may indicate an imbalance in the formation of an adequate immune response. It has been demonstrated that an elevated level of IL-18 in seminal fluid in idiopathic infertility correlates with a decrease in sperm motility. When analyzing patients regarding the etiological factor causing azoospermia, it was found that the largest percentage of the disease is caused by Chlamydia spp..
However, with NOA, the frequency of detection of Chlamydia trachomatis was 3.3%, and with OA - 2.9%. Mycoplasma hominis was found in 5.7% of patients with NOA, and in 2.9% of patients with OA. Ureaplasma urealyticum was diagnosed in 12.3% of NOA and 11.7% of OA, and Ureaplasma рarvum in 13.1% of NOA and 19.1% of OA. In NOA, Neisseria gonorrhoeae was detected in 6.6%, and in OA - in 13.2%. Herpes simplex virus type 2 was noted in 5.7% of men with NOA and in 7.3% of men with OA. Gardnerella spp. diagnosed in 9.0% of men with NOA and in 13.3% of men with OA. The frequency of detection of Enterococcus faecalis in men with azoospermia in OA is 32.3%, which is almost twice as high as in NOA (17.2%). Infection of ejaculate/prostate secretion with E. coli in NOA was found in 13.1%, and in OA - in 23.5%. Staphylococcus aureus was found only in OA (4.4%). Streptococcus pyogenes was detected both in NOA (7.4%) and in OA (13.2%). Streptococcus agalactiae was detected only in OA - 4.4%. Klebsiella spp. found in 0.8% of patients with NOA and in 1.5% of patients with OA. It was found that the largest percentage of autoimmune joint pathology was caused by Chlamidia trachomatis (36%), Streptococcus pyogenes – 19%, Chlamidia trachomatis and Ureaplasma urealyticus – 5%. It should be noted
that the infection caused by Ureaplasma urealyticum is the most dangerous for male reproductive function. In our research, the highest percentage of this pathogen among other microorganisms was found, with NOA – 12.3%, and with OA – 11.7%. This pathogen changes various characteristics of the spermatogenesis process, in particular,
the spermatogenic epithelium and spermatozoa. Thus, as a result of the conducted research, it was found that in various types of male pathospermia, idiopathic infertility and infertility in combination with rheumatoid arthritis, biochemical and immune changes occur not only in seminal plasma and spermatozoa, but also in blood serum and lymphocytes. These changes are especially manifested in the disruption of the regulatory systems of the cell - pro- and antioxidant, arginase-NO-synthase and Ca2+-ATP-dependent. Significant changes occur in the ratio of subpopulations of lymphocytes, in the increase in the concentration of pro- inflammatory cytokines and the presence of pathogenic urogenital microflora. An increase in the activity of the inducible isoform of NO-synthase in seminal plasma, the ratio of reduced to oxidized glutathione, the redox index of reduced glutathione, the
ratio of the activity of arginase to the inducible isoform of NO-synthase, and the ratio of metabolites of nitric oxide - NO3- can be important additional prognostic indicators of infertility NO3 - /NO2 -.

Key words: male infertility, pathospermia, inflammatory joint diseases, spermatozoa, lymphocytes, oxidative stress, antioxidant protection, ATPases, NO- synthases, nitric oxide, interleukins, microbiota.