Вікові аспекти фізіологічної ролі брижі та її жирової тканини за умов стресу

АНОТАЦІЯ

Ревенко Олег Вікторович. Вікові аспекти фізіологічної ролі брижі та її жирової тканини за умов стресу (експериментальне дослідження). –
Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 222 «Медицина», галузь знань 22 «Охорона здоров’я». –
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, МОЗ України, Львів, 2022.
Дана робота присвячена вивченню фізіологічного значення брижі та її жирової тканини у віковому аспекті за умов висококалорійного високофруктозного харчування, індукції гострого стресу та їхнього комбінованого впливу, а також дослідженню біорегуляторного впливу сірководню (H 2 S) у збережені цілісності брижі за умов моделювання пошкоджень різного ґенезу. Вперше вивчено вікові особливості ультрамікроскопічної структурної організації компонентів брижі у нормі та закономірностей її перебудови за умов індукції гострого стресу у щурів різного віку. При вивченні вікових відмінностей морфо-функціональної ультраструктурної організації брижі та її клітинних компонентів за допомогою електронномікроскопічного дослідження, виявлено, що у старих щурів в порівнянні до дорослих, наявні ознаки дегенеративних змін мезентеріальних адипоцитів, фрагментація великих ліпідних крапель, поява дефектних мітохондрій різної форми, а також виявлено ознаки ультраструктурних змін у мезентеріальних мікросудинах та присутність деструктивно змінених фібробластів. Вперше проведено комплексні морфо-функціональні дослідження тканин брижі та її компонентів за допомогою електронномікроскопічного методу в аспекті встановлення особливостей вікових змін за умов поєднаного впливу 4-тижневого високофруктозного харчування та індукції гострого стресу. У тварин в моделях пошкоджень, викликаних 28-миденною високофруктозною дієтою (HFD), виявлено цитолітичні зміни клітин брижі, що мали більш виражений характер у старих тварин порівняно до дорослих щурів. Характерними проявами даних змін була наявність дегенеративних змінених, гіпертрофічних та гіперпластичних мезентеріальних адипоцитів з пошкодженими мітохондріями різної форми, ознаки ендотеліальної дисфункції та дезорганізованої сполучної тканини. Вплив гострого стресу виявив вікові відмінності в адаптивно-компесаторних механізмах тканинних компонентів брижі з підвищенням її чутливості до цитолітичного впливу у старих щурів за умов перебування на HFD. При віковому порівнянні у старих тварин виявлено збільшення вмісту реактивних субстанцій тіобарбітурової кислоти (TBARS) у сироватці крові на 40% відповідно до дорослих щурів (p<0,05). За умов HFD визначено збільшення вмісту TBARS на 12-15% в обох вікових групах порівняно до аналогічних вікових груп на стандартній дієті (p<0,05). Дані результати свідчать про появу окисного стресу, що викликаний порушенням окисно-відновлювальної рівноваги та цитолітичним пошкодженням брижі та її компонентів. Дані зміни у подальшому можуть стати тригером для виникнення розладів у метаболічному здоров’ї. Вперше проведено дослідження вікових відмінностей ролі Н 2 S в адаптаційно-компенсаторних реакціях тканини брижі щурів за умов 4-тижневої високофруктозної дієти, індукції гострого стресу та екзогенного введення донорів синтезу сірководню. Визначено вплив екзогенних донорів H 2 S на вміст TBARS у сироватці крові та активність ензимів цистатіонін γ- ліази (CSE), цистатіонін β-синтази (CBS), сульфіт оксидази (SO) і тіосульфат- сульфуртрансферази (TST) у гомогенатах тканин брижі у щурів різного віку. Нами з’ясовано особливості впливу екзогенних донорів синтезу сірководню: натрій гідросульфіду (NaHS) і гібридного Н 2 S-асоційованого аспірину (H 2 S-аспірину, ATB-340) на баланс про- та антиоксидантних чинників у брижі щурів різного віку. Досліджено резистентність брижі та її жирової тканини у моделях вікових змін експериментального метаболічного ушкодження за допомогою гіперкалорійної 4-тижневої високофруктозної дієти, індукції гострого стресу, за умов попереднього 9-тиденного введення екзогенних донорів синтезу Н 2 S: NaHS і H 2 S-аспірину (ATB-340) до індукції гострого пошкодження та проведено порівняння отриманих результатів з дією класичного аспірину. Вперше описано порівняльну характеристику впливу екзогенних донорів сірководню на зміни показників вмісту TBARS у сироватці крові і активність ензимів СBS, CSE, SO, TST у гомогенатах брижі у віковому аспекті та за умов високофруктозного харчування. Дослідження вікових відмінностей проявів адаптаційно-компенсаторних механізмів брижі за умов впливу гострого стресу та корекції ендогенного синтезу сірководню введенням екзогенних донорів Н 2 S виявило зменшення процесів перекисного окиснення ліпідів і важливість ендогенної активності ензимів СBS, CSE, SO i TST у забезпеченні резистентності брижі та її жирової тканини до
пошкодження за рахунок дії біорегуляторного впливу H 2 S. Вперше описано особливості взаємозв’язку цитопротекції мезентеріальних адипоцитів та мікросудин і фібробластів за умов моделювання ендогенного синтезу Н 2 S та поєднаного впливу високофруктозного харчування і гострого стресу. З’ясовано особливості впливу екзогенних донорів Н 2 S на прикладі NaHS та Н 2 S-аспірину на забезпечення окисно-відновної рівноваги за замінами вмісту TBARS та активністю ензимів СBS, CSE, SO, TST у гомогенатах брижі щурів різного віку за умов поєднаного впливу стресу та високофруктозного харчування. Виявлено, що ендогенний Н 2 S бере активну участь у забезпечені міжклітинної комунікації у мезентеріальній тканині, цитопротекції та механізмах регуляції окисно-відновної рівноваги, проявляючи антирадикальну дію та протекторну дію на мітохондрії мезентеріальних адипоцитів за умов стресу. Встановлено, що H 2 S відіграє важливу роль у нормалізації мітохондріальної дисфункції мезентеріальних адипоцитів та відновленні окисно-відновної рівноваги за умов змін, викликаних високофруктозним харчуванням та старінням. Дані спостереження можна використати у перспективі для вироблення нових профілактичних і терапевтичних стратегій для підтримки метаболічного здоров’я та лікування метаболічних розладів. Використання гібридного H 2 S-асоційованого аспірину, як ендогенного донора синтезу H 2 S є перспективним з огляду на залучення H 2 S у клітинні механізми забезпечення редокс-рівноваги і природної резистентності брижі до дії цитолітичних пошкоджувальних чинників. Виявлено вікові відмінності каталітичної активності ензимів ендогенного синтезу H 2 S у дорослих і старих щурів, за умов індукції гострого стресу та HFD. Виявлено зменшення активності ензиму CBS у гомогенатах брижі щурів на 70% (p<0,05) за умов перебування на високофруктозному харчуванні. Застосування екзогенних донорів H 2 S спричинило зменшення активності ензиму SO в гомогенатах брижі та зменшенням сироваткового вмісту TBARS, в обох вікових групах щурів, як за умов стандартного харчування, так і при високофруктозному харчуванні, що можна трактувати, як непрямий доказ нормалізації енергетичних та окисних процесів у тканинах брижі.
Виявлено, що зміни брижі та її тканинних компонентів – мезентеріальних адипоцитів, їхніх мітохондрій та мезентеріальної сполучної тканини можуть носити оборотний характер за умов застосування екзогенних донорів синтезу H 2 S – NaHS та ATB-340, що опосередковано підтверджує
цитопротекторні властивості ендогенного H 2 S. Застосування екзогенних донорів H 2 S – NaHS і ATB-340, які володіють властивостями збільшувати у тканинах ендогенний вміст H 2 S, сприяє кращому зрозумінню механізмів формування вікових змін резистентності тканини брижі та розумінню
значення ендогенного синтезу H 2 S у протидії пошкоджувальним чинникам, що лежать в основі мезентеріальної патології. Отримані результати у перспективі можуть бути корисними для розробки науково обґрунтованих засад оптимальної профілактики та лікування патологій брижі та її компонентів. Встановлено, що екзогенне введення NaHS для покращення ендогенного вмісту H 2 S викликало зменшення вмісту TBARS у старих щурів за умов високофруктозної дієти та індукції гострого стресу, що може свідчити про зменшення інтенсивності окисного впливу на тлі введення NaHS. Дослідження продемонстрували існування вікових відмінностей у активності ензимів CBS, CSE, TST брижі, а саме зменшення активності даних ензимів у щурів при старінні. Встановлено, що HFD викликає зменшення активності відповідних ензимів, тоді як введення екзогенних донорів H 2 S спричиняє збільшення активності – CBS, CSE, TST, що свідчить про збільшення ендогенного синтезу H 2 S, що проявляється його мультифункціональною дією через вазодилятаційний, антиокисний і протиапоптичний ефекти. Результати комплексного морфо-функціонального дослідження брижі та біохімічного дослідження активності ензимів синтезу H 2 S поглиблюють розуміння фізіологічних основ клітино-молекулярних механізмів функціонування брижі її клітинних компонентів та біорегуляторного впливу H 2 S. Дослідження поглиблюють розуміння фізіологічного значення брижі та її жирової тканини за умов високовуглеводного харчування та стрес- індукованих пошкоджень. Встановлено значення брижі та її жирової тканини на стрес-резистентність організму за умов одинарного і поєднаного впливу гострого стресу та високофруктозного харчування у щурів різного віку. Вивчення біомаркерів перекисного окиснення ліпідів на основі визначення вмісту TBARS у сироватці крові та активності ензимів СBS, CSE, SO i TST у гомогенатах брижі, що беруть участь у ендогенному синтезі H 2 S, дозволило з’ясувати механізми впливу H 2 S на брижу та мезентеріальні адипоцити у віковому аспекті та за умов експериментальних метаболічних пошкоджень, викликаних високофруктозним харчуванням. Результатами наших досліджень вперше продемонстровано, що H 2 S-пов’язані шляхи регуляції є важливими для мезентеріальних цитопротекторних реакцій та забезпечують відновлення порушень окисно-відновної рівноваги. Виявлені особливості цитопротекторних механізмів брижі за умов модифікації ендогенного вмісту Н 2 S вказують на перспективність доклінічних досліджень донорів сірководню, а саме гібридного нестероїдного протизапальногопрепарату, H 2 S-аспірину, як можливого безпечного терапевтичного засобу.

Ключові слова: брижа, адипоцити, ендотелій, вікові зміни, гідроген сульфід (Н 2 S), окисно-відновна система, високофруктозна дієта (HFD), CBS,
CSE, TST, SO.

ABSTRACT

Oleh Viktorovych Revenko. Age-related aspects of the physiological role of the mesentery and its adipose tissue under stress (experimental study). –
Qualifying scientific work as a manuscript. A thesis for obtaining the scientific degree of a Doctor of Philosophy majoring in 222 Medicine, a field of study 22 Healthcare. – Danylo Halytsky Lviv National Medical University, MoH [Ministry of Health] of Ukraine, Lviv, 2022.
The thesis is devoted to the study of the physiological role of the mesentery and its adipose tissue in terms of age under a high-calorie high fructose diet, acute stress induction, and their combined impact, as well as to the study of the bioregulatory influence of hydrogen sulfide (H 2 S) on the preservation of mesenteric intactness while modeling damages of various origin. The peculiarities of the ultramicroscopic structural organization of mesenteric elements within normal limits and patterns of its transformation when aging, and in terms of acute stress induction in rats of various ages were first studied. When studying the age-related differences of morphofunctional ultrastructural organization of mesentery and its cellular elements using electron microscopy, it has been determined that old rats as compared to adult rats presented signs of degenerative changes of mesenteric adipocytes, fragmentation of large lipid droplets, the occurrence of defect mitochondria of various shape, and detected signs of ultrastructural changes in mesenteric microvessels and presence of destructively changed fibroblasts. Complex morphofunctional studies of mesenteric tissue and its components through electron microscopy were first conducted in terms of determining the peculiarities of the age-related changes under conditions of a combined influence of a 4-week high fructose diet and acute stress induction. The animals with patterns of damage induced by a 28-day high fructose diet (HFD) developed the cytolytic
changes of mesenteric cells, being more marked in old rats as compared to adult rats. The specific features of the mentioned changes were represented by degeneratively changed, hypertrophic, and hyperplastic mesenteric adipocytes with damaged mitochondria of various shapes, endothelial dysfunction and the presence of disorganized connective tissue. The influence of acute stress detected the age- related differences in adaptation and compensatory mechanisms of mesenteric tissue components with its increased sensitivity to cytolytic influence in old rats being on an HFD. The increased level of TBARS in blood serum for 40% was found in old rats as compared to adult rats (p<0.05) when conducting an age-based comparison. The increased level of TBARS for 12-15% was detected in both age groups being on an HFD as compared to similar age groups on a standard diet (p<0.05). The results evidence the development of the oxidative stress induced by impaired oxidation-reduction equilibrium and cytolytic damage to the mesentery and its components. The mentioned changes can subsequently trigger the impairment of metabolic health. The age-related differences of Н 2 S role in adaptation and compensatory reactions of mesenteric tissue of rats under conditions of a 4-week high fructose diet, acute stress induction, and exogenous infusion of hydrogen sulfide synthesis donors were first studied. The influence of the exogenous H 2 S donors on the level of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in blood serum and activity of cystathionine γ-lyase enzyme (CSE), cystathionine β-synthase (CBS), sulfite oxidase (SO), and thiosulfate sulfurtransferase (TST) in mesenteric tissue homogenates in rats of various age has been determined. We have determined the peculiarities of influence of exogenous hydrogen sulfide synthesis donors: sodium hydrosulfide (NaHS) and hybrid Н 2 S-associated aspirin (Н 2 S-aspirin, ATB-340) on a balance of pro- and antioxidant factors in the mesentery of rats of various ages. The resistance of mesentery and its adipose tissue was studied in patterns of age-specific changes of experimental metabolic damage using a hypercaloric 4-week high fructose diet, acute stress induction, upon the condition of a 9-day infusion of exogenous H 2 S synthesis donors: NaHS and H 2 S-aspirin (ATB-340) before acute damage induction, and the obtained findings were compared to the typical aspirin's effect. The comparative analysis of the exogenous H 2 S donors' influence on the change of TBARS level in blood serum and СBS, CSE, SO, TST enzymes activity in mesenteric homogenates was first described in terms of age and under conditions of a high fructose diet. The study of mesenteric adaptation and compensatory mechanisms under conditions of acute stress impact and correction of hydrogen sulfide endogenous synthesis by infusion of exogenous H 2 S donors demonstrated the reduced lipid peroxidation processes and the importance of the endogenous activity of СBS, CSE, SO, and TST enzymes in the provision of the resistance of mesentery and its adipose tissue to damage due to H 2 S bioregulatory impact. The peculiarities of the relationship of cytoprotection of mesenteric adipocytes and microvessels and fibroblasts during modeling of Н 2 S endogenous synthesis and combined influence of a high fructose diet and acute stress were first described. The peculiarities of Н 2 S exogenous donor's influence on oxidation- reduction equilibrium provision were determined using NaHS and Н 2 S-aspirin as based on change of TBARS level and СBS, CSE, SO, TST enzymes activity in mesenteric homogenates of rats of various age in terms of a combined impact of
stress and high fructose nutrition. It has been determined that the endogenous Н 2 S actively participates in the provision of intercellular communication in mesenteric tissue, cytoprotection, and mechanisms of oxidation-reduction equilibrium regulation, demonstrating the anti- radical and protective effect on mesenteric adipocytes mitochondria under stress. It has been defined that H 2 S plays an important role in the normalization of mitochondrial dysfunction of mesenteric adipocytes and restoration of oxidation- reduction equilibrium in terms of changes triggered by a high fructose diet and aging. The mentioned findings can be applied in the long term for developing new prevention and therapeutic approaches to the maintenance of metabolic health and treatment of metabolic disorders. Application of hybrid H 2 S-associated aspirin as an endogenous donor of H 2 S synthesis is advantageous considering H 2 S involvement in the cellular mechanisms of redox balance provision and physiological resistance of the mesentery to influence cytolytic damaging factors. The age-related differences in the catalytic activity of enzymes of H 2 S endogenous synthesis in adult and old rats under conditions of acute stress induction and HFD were determined. Under conditions of being on a high fructose diet, the CBS enzyme activity was reduced by 70% (p<0.05) in mesenteric homogenates. The application of H 2 S exogenous donors resulted in the reduced activity of SO enzyme in mesenteric homogenates and the decreased level of TBARS in serum in both age groups of rats, under conditions of being on a standard diet, as well as on a high fructose diet, which can be interpreted as indirect evidence of energy and oxidative processes normalization in mesenteric tissue.
It has been determined that changes of the mesentery and its tissue components – mesenteric adipocytes, their mitochondria, and mesenteric connective tissue – can be reversible under conditions of application of exogenous donors of H 2 S synthesis – NaHS and ATB-340, which indirectly confirms the
cytoprotective features of endogenous H 2 S. The application of H 2 S exogenous donors – NaHS and ATB-340, which can increase the level of endogenous H 2 S in tissue, contributes to a better understanding of formation mechanisms of age- specific changes in mesenteric tissue resistance and understanding of H 2 S endogenous synthesis significance in resistance to damaging factors, which are the basis for mesenteric pathology. The obtained findings can be useful for the future development of scientifically substantiated principles of adequate prevention and treatment of mesentery and its components pathology. It has been defined that the exogenous infusion of NaHS for the improvement of H 2 S level in tissue triggered the decrease of TBARS level in old rats under conditions of a high fructose diet and acute stress induction, which can evidence the reduced intensity of oxidative influence secondary to NaHS infusion. The studies demonstrated the age-specific differences in the activity of CBS, CSE, TST mesenteric enzymes, namely the reduced activity of the mentioned enzymes in rats with aging. It has been defined that an HFD causes the reduced activity of the relevant enzymes, meanwhile, the infusion of H 2 S exogenous donors results in the increased activity of – CBS, CSE, TST, which evidences the increased synthesis of H 2 S, which is manifested by its multifunctional impact, vasodilatory, antioxidative and antiapoptotic effects. The results of the complex morphofunctional study of the mesentery and biochemical study of the activity of H 2 S synthesis enzymes provide a more profound understanding of the physiological basis of the cellular and molecular mechanisms of functioning of the mesentery and its cellular components, and the bioregulatory impact of H 2 S. The research provides a more profound understanding of the physiological value of mesentery and its adipose tissue under conditions of a high carbohydrate diet and stress-induced damages. The influence of the mesentery and adipose tissue on body stress resistance under conditions of the single and combined impact of acute stress and high fructose diet in rats of various ages has been determined. Study of lipid peroxidation biomarkers based on the determination of
TBARS level in blood serum and СBS, CSE, SO, TST enzymes activity in mesenteric homogenates, which participate in H 2 S endogenous synthesis, allowed
for defining the mechanisms of H 2 S influence on the mesentery and mesenteric adipocytes in terms of age and under conditions of experimental metabolic damages, induced by a high fructose diet. Our research findings first demonstrated that H 2 S-associated means of regulation are important for mesenteric cytoprotective reactions and provide restoration of the impaired oxidation-reduction equilibrium. The determined peculiarities of mesenteric cytoprotective mechanisms in terms of modification of endogenous Н 2 S denote the advantages of the preclinical studies of hydrogen sulfide donors, a namely hybrid non-steroidal anti-inflammatory drug, H 2 S-aspirin, as a possible therapeutic agent.

Keywords: mesentery, adipocytes, endothelium, age-related changes, hydrogen sulfide (H 2 S), redox system, high-fructose diet (HFD), CBS, CSE, TST,
SO.

https://drive.google.com/file/d/1wVz0pSthSIfex2vaiYaffYdqi7YwmARb/view?usp=sharing