Інфільтративний протоковий рак грудної залози: клініко-морфологічні та імуногістохімічні особливості різних молекулярних підтипів і прогнозування перебігу.

Дудаш А.П. Інфільтративний протоковий рак грудної залози: клініко-морфологічні та імуногістохімічні особливості різних молекулярних підтипів і прогнозування перебігу. - Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 222 – «Медицина» (22 – «Охорона здоров’я»). – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України,
Львів, 2023.
Дисертація присвячена підвищенню якості діагностики інфільтративного протокового раку грудної залози шляхом визначення клініко-морфологічних, ультраструктурних та імуногістохімічних особливостей молекулярних підтипів та встановлення їх зв’язку з прогностичними чинниками перебігу захворювання. Рак грудної залози (РГЗ) є одним з найчастіше діагностованих онкологічних захворювань та основною причиною смерті від раку серед жінок у всьому світі, визначається як група захворювань з варіабельною морфологією, молекулярними особливостями, поведінкою та відповіддю на терапію. Зі збільшенням можливостей лікування в епоху прецизійної медицини традиційні клініко-патологічні прогностичні змінні і встановлені молекулярні прогностичні маркери виявилися недостатніми для відображення такого ступеня гетерогенності. Необхідний пошук додаткових молекулярних маркерів для персоналізованого підходу до терапії, а для вдосконалення лікування раку необхідні прогностичні біомаркери. У зв’язку з цим, на чільне місце в прогнозуванні виживаності виходить молекулярна морфопатологія. Відмінності в експресії таких маркерів, як епітеліальний кадгерин (Е- кадгерин), що відіграє важливу роль у процесі клітинної адгезії, є потужним супресором інвазії та метастазування, циклооксигеназа-2 (COX-2) і її важлива роль у пухлинній трансформації, проліферації клітин і неоваскуляризації, розподіл інфільтруючих пухлину лімфоцитів, щільність та інтенсивність їх експресії, зможуть пояснити, чому порівнювані за поширеністю і гістологічною структурою пухлини відрізняються за перебігом захворювання. Таким чином, встановлення клініко-морфологічних, ультраструктурних та імуногістохімічних особливостей молекулярних підтипів інфільтративного протокового РГЗ та дослідження їх зв’язку з відомими прогностичними чинниками допоможуть визначити перебіг захворювання і стануть основою до персоніфікованого лікування для запобігання розвитку рецидивів і метастазів у хворих на РГЗ. Вирішення поставленої мети було досягнуто завдяки застосуванню сучасних методів дослідження інфільтративного протокового РГЗ: гістологічних, імуногістохімічних, електронно-мікроскопічних, морфометричних і статистичної обробки цифрових даних. Основою наукової роботи було комплексне клініко-морфологічне дослідження 193 випадків інфільтративного протокового РГЗ. Цільова вибірка для дослідження формувалася ретроспективно із загального варіаційного ряду хворих на інфільтративний протоковий РГЗ, яким не проводилася неоад’ювантна хіміо-променева чи гормонотерапія та попередні хірургічні втручання. Дані про хворих на інфільтративний протоковий РГЗ містяться в архівах Львівського онкологічного регіонального лікувально-діагностичного центру. Після проведення стандартизації за цільовими віковими, клінічними та гістологічними параметрами загальна вибірка із 193 хворих була класифікована на основі статусу експресії ER / PR / HER-2/neu та Ki-67 на чотири молекулярні підтипи відповідно консенсусних визначень молекулярних підтипів St. Gallen і сформовані наступні когорти: люмінальний А підтип; люмінальний В підтип; Her-2/neu+; потрійний негативний. ІГХ дослідження проводили на зрізах із парафінових блоків, призначених для стандартного морфологічного дослідження, відповідно до протоколу виробника з необхідними контролями. В ході проведення ІГХ дослідження нами дана оцінка імуногістохімічного забарвлення ER, PR, Her-2/neu і Кі-67, CD3, CD20 і CD56, COX-2, E-кадгерин та CD31. Окрім світлової, нами використана скануюча електронна мікроскопія, яка є методом дослідження поверхні зразків. Для оцінки зв'язків між клініко-патологічними ознаками, імуногістохімічними маркерами використовували непараметричний аналіз з обчисленням коефіцієнта рангової кореляції Спірмена (R), для прогнозування пухлино-інфільтруючих лімфоцитів – мультифакторний регресійний аналіз. Проведений ретроспективний аналіз розподілу пацієнток загальної вибірки на взаємовиключні молекулярні підтипи за допомогою імуногістохімії щодо ER, PR, Кі-67 та білка HER-2/ neu показав найбільший відсоток зразків з рецепторним профілем люмінального А раку грудної залози (40,93%), що було майже у 2 рази більше від люмінального В підтипу (22,28%) та HER-2/neu+ (20,21%), і в 2,5 раза більше від потрійного негативного підтипу (16,58%). Порівняльний морфологічний аналіз інвазивного компонента протокового РГЗ дозволив встановити внутрішньопухлинну гетерогенність і виявити структурні особливості молекулярних підтипів пухлин. Змішана морфологічна картина найчастіше діагностувалася у пухлинах люмінального А підтипу і переважала в 3,2 раза, ніж у пухлинах потрійного негативногопідтипу, у 2,03 раза частіше діагностувалася, ніж в Her-2/neu+ раку грудної залози і в 1,41 раза – ніж у люмінальному В підтипу (р<0,05). Достовірне переважання морфологічних структур одного типу виявлялося в потрійному негативному РГЗ в 1,9 раза порівняно з Her-2/neu+, у 5 разів – порівняно з люмінальним А підтипом, в 4,4 раза – порівняно з люмінальним В підтипом (р<0,05). Скануюча електронна мікроскопія дозволила виділити три варіанти поверхневої конфігурації пухлинних клітин протокового раку грудної залози залежно від ступеня диференціювання і гістолоґічної будови інвазивного компонента. Дослідження адгезії між пухлинними клітинами показало, що низька експресія Е-кадгерину чи її відсутність, яка спостерігалася у 53,49% випадків раку грудної залози, пов’язана з пухлинами розміром ≥5 см, ураженням лімфатичних вузлів N1-2, з G2 i G3 ступенями злоякісності і переважала в потрійному негативному підтипі (70%; р=0,011). Високий рівень експресії Е- кадгерину переважав у люмінальному А підтипі (64%; р=0,023) та достовірно прямо корелював з відсутністю метастатичного ураження лімфатичних вузлів N0 (r= +0,48; р=0,00002) і з високим ступенем диференціації G1 (r= +0,23; р=0,03), а також зворотно – з N2 (r= -0,55; р=0,0001) і з низьким ступенем диференціації пухлини G3 (r= -0,26; р=0,016). Оцінюючи активність ферменту COX-2, нами встановлено надмірну експресію в пухлинах потрійного негативного (75%) та Her-2/neu+ підтипів (73,68%) в порівнянні з люмінальним А (20%) та люмінальним В (50%) підтипами. В карциномах потрійного негативного підтипу встановлено достовірний прямий помірний зв'язок між надекспресією COX-2 та N2 (r= +0,38; р <0,05) і зворотний високий кореляційний зв'язок з N0 (r= -0,71; р=0,0004); у пухлинах з Her-2/neu+ підтипом достовірний прямий високий зв'язок з N (r= +0,77; р=0,0001), помірний прямий зв'язок з N2 (r= +0,57; р =0,01). У сукупності надмірна експресія СОХ-2 асоціювалася з потрійним негативним та Her-2/neu+ фенотипами з метастатичним ураженням лімфатичних вузлів.
Дослідження ангіогенезу показало, що найбільш значущими з прогностичної точки зору були атипові дилатовані судини та структури з частковою ендотеліальною вистилкою. Множинні атипові дилатовані капіляри діагностувалися в інтратуморальній стромі і переважали в потрійному негативному (40%) і HER-2/neu+ (26,32%) підтипах. Множинні структури з частковою ендотеліальною вистилкою корелювали з G2 (r= +0,22; р=0,046) та G3 (r= +0,30; р=0,005), з N2 (r= +0,44; р<0,00001), значна їх кількість спостерігалася в потрійному негативному підтипі (р<0,05). Наявність пухлино-інфільтруючих лімфоцитів визнано важливим імунологічним біомаркером, який відображає протипухлинну імунну відповідь при раку грудної залози. У всіх варіантах порівняння показників за видами лімфоцитів (внутрішньопухлинних і на інвазивному краї) встановлено достовірну різницю р<0,001. Щільність розподілу CD3- і CD20-лімфоцитів була більшою внутрішньопухлинно і біля інвазивного краю в нелюмінальних підтипах в порівнянні з люмінальними А і В підтипами. Найменша щільність розподілу CD56-клітин серед пухлино-інфільтруючих лімфоцитів виявлялася внутрішньопухлинно при люмінальних підтипах. Відсоток інфільтратів CD3 і CD20 як всередині пухлинного вогнища, так і на інвазивному краї, а також CD56 на інвазивному краї був значно нижче при G1 і G2, ніж при G3 (p <0,01). Встановлено кореляційні парні та множинні (поєднані) взаємозв’язки між клініко-морфологічними та імуногістохімічними параметрами, які сприяють визначенню перебігу захворювання. В карциномах G3 потрійного негативного підтипу спостерігається низька експресія Е-кадгеринів, надекспресія СОХ-2 і зростає частка CD3 внутрішньопухлинних лімфоцитів. У люмінальному А підтипі встановлено поєднаний взаємозв’язок між високою експресією Е-кадгерину, низькою щільністю розподілу CD3 лімфоцитів на інвазивному краї пухлини і морфологічною будовою інвазивного компонента переважно з різних типів структур. Моделювання прогностичних рівнів скупчень пухлино-інфільтруючих лімфоцитів при різних молекулярних підтипах інфільтративного протокового раку грудної залози дало змогу спрогнозувати значення показників CD3, CD20, CD56 для пацієнтів кожної групи залежно від поданих чинників. У 77,6% випадків потрійного негативного підтипу наявність пухлини розміром Т2 (р=0,013) із ступенем диференціації пухлини G (p= 0,0003) і високим рівнем експресії СОХ-2 буде мати прямий вплив на значення показника CD3 на інвазивному краї. У хворих з люмінальним А підтипом у 95,4% випадків доведений сильний вплив чотирьох незалежних предикторів на значення показника CD20 на інвазивному краї: стадія пухлини Т1 (р=0,0000), метастатичне ураження лімфатичних вузлів (N, p<0,0001), переважання різних типів морфологічних структур в інвазивному компоненті (р=0,0000) і наявність структур з частковою ендотеліальною вистилкою (р=0,037). Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що інфільтративна протокова карцинома грудної залози демонструє гетерогенність морфологічної будови та ультраструктури інвазивного компоненту залежно від молекулярно підтипу. Показано, що люмінальні раки грудної залози різноманітні за морфологічною будовою інвазивного компонента, а достовірне переважання морфологічних структур одного типу визначено в потрійному негативному раку грудної залози в 1,9 раза порівняно з Her-2/neu+, у 5 разів – порівняно з люмінальним А підтипом, в 4,4 раза – порівняно з люмінальним В підтипом (р<0,05). Отримано додаткові дані про ультраструктуру клітинної поверхні інфільтративного протокового раку грудної залози. Встановлено, що зменшення або відсутність асиметричних мікроворсинок на клітинній поверхні діаґностувалося при ступенях злоякісності G2 і G3. Визначено рівні експресії Е-кадгерину, СОХ-2, CD31, лімфоїдної запальної інфільтрації в молекулярних підтипах інфільтративного протокового раку грудної залози і їх зв’язок з відомими прогностичними чинниками. Уточнено наукові дані про морфологію мікросудин в інвазивному компоненті потрійного негативного і Her2/neu+ молекулярних підтипів – наявність множинних атипових дилатованих капілярів і структур з частковою ендотеліальною вистилкою в інтратуморальній стромі. Вперше встановлено особливості лімфоїдного мікрооточення та оцінено розподіл інфільтруючих пухлину Т-і В-лімфоцитів та NK-клітин в різних молекулярних підтипах, свідченням чого є достовірне переважання щільності Т- і В-лімфоцитів внутрішньопухлинно і біля інвазивного краю в нелюмінальних підтипах в порівнянні з люмінальними А і В; щільність внутрішньопухлинних Т-лімфоцитів була найвищою в потрійному негативному раку і значно достовірно переважала за щільність в люмінальному підтипі А (p <0,01). Досліджено кореляційні та поєднані взаємозв’язки між експресією маркерів, що характеризують інвазивні властивості пухлини, і відомими прогностичними чинниками перебігу захворювання. Вперше на моделі прогнозування рівнів пухлино-інфільтруючих лімфоцитів встановлений вплив незалежних клініко-патогістологічних факторних ознак на рівень лімфоцитів (внутрішньопухлинних та на інвазивному краї) в люмінальних і нелюмінальних карциномах грудної залози. Практичне значення отриманих результатів. Розроблено та впроваджено в практику спосіб оцінки стану мікросудин в інфільтративному протоковому раку грудної залози. Його значення полягає в тому, що наявність в потрійному негативному і Her2/neu+підтипах множинних атипових дилатованих капілярів і структур з частковою ендотеліальною вистилкою в інтратуморальній стромі є значущим несприятливим морфологічним прогностичним чинником (Інф. лист №2-2023). Доведено важливість встановлення морфологічних особливостей інвазивного компонента і внутрішньопухлинної гетерогенності в протоковому раку грудної залози. Запропоновано виділення пухлин з надмірною експресією COX-2 в окрему групу, так як вона асоціювалася з потрійним негативним та Her-2/neu+ фенотипами з метастатичним ураженням лімфатичних вузлів.
Результати дослідження дозволяють проаналізувати можливість прогнозування перебігу захворювання на основі визначення рівня експресії Е- кадгеринів в пухлинній тканнині та порівняння за експресією в люмінальних та нелюмінальних підтипах. Запропонована регресійна мультифакторна модель дозволяє спрогнозувати значення показників CD3, CD20, CD56 в інфільтративному протоковому раку грудної залози залежно від поданих факторних ознак, що має медичне та економічне значення, дасть змогу приймати оперативне рішення стосовно лікування без очікування результатів дороговартісних досліджень.

https://drive.google.com/file/d/1qlAbUwmsuvlbOvsSYuajXXVXsDy7Xo9k/view?usp=sharing