Фармакогностичне дослідження крокусу посівного та рослин роду Ірис: перспективи комплексного використання та оптимізація вирощування

Михайленко О.О. Фармакогностичне дослідження крокусу посівного та рослин роду Ірис: перспективи комплексного використання та оптимізація вирощування. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 «Фармацевтична хімія та фармакогнозія». – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, МОЗ України, Львів, 2024.
Дисертаційна робота присвячена теоретичному обґрунтуванню та експериментальному вирішенню наукової проблеми пошуку та забезпечення якості нових фітосубстанцій крокусу посівного та рослин роду Ірис з
використанням сучасних наукових підходів для комплексного використання рослин та забезпечення стабільного складу біологічно активних компонентів у лікарській рослинній сировині шляхом визначення умов та етапів належного вирощування. Планування експерименту зроблено з урахуванням підходу «Якість
шляхом розробки» для забезпечення оптимізації цілеспрямованого пошуку протипухлинних/противірусних рослинних екстрактів з сировини крокусу посівного та рослин роду Ірис. Визначено критичні етапи забезпечення якості рослинних екстрактів, а саме: контроль якості сировини, допоміжних матеріалів і
процесу екстракції. За допомогою діаграми Ісікава (якісна оцінка ризиків) та за допомогою Аналізу режиму відмови та наслідків (кількісна оцінка) були визначені потенційно критичні точки виробництва, що впливають на якість рослинних екстрактів: умови вирощування, переробка рослинної сировини, технологія екстракції.
Проведено порівняльне дослідження хімічного складу 57 зразків шафрану з 13 країн світу (в тому числі 35 зразків з 12 регіонів України). Досліджено побічні продукти виробництва шафрану – листя, оцвітину та
бульбоцибулини. Проведено хімічний аналіз рослин роду Ірис, що включав 38 видів та 34 сортів з України, Азербайджану, Литви та Латвії. Відповідно до вимог ISO 363235 встановлено, що зразки шафрану з України мають показники на рівні зразків з Іспанії, Італії, Марокко, Австралії, Швейцарії та відповідають 1 категорії якості відповідно до вмісту кроцинів, пікрокроцину та шафраналю. Обґрунтовано доцільність використання методу подрібнення сировини у рідкому азоті, що збільшує вихід кроцинів у 3,5 рази порівняно зі звичайним подрібненням. Вперше розроблена методика ВЕРХ дозволила точно визначити апокаротиноїди, шафраналь, пікрокроцин та фенольні сполуки у зразках шафрану. За вмістом кроцин t-4GG українські зразки
шафрану були більш подібні до шафрану зі Швейцарії (446-475 мг/г). Кореляційний аналіз вмісту речовин-маркерів шафрану з факторами навколишнього середовища показав, що вміст фенольних сполук та
апокаротиноїдів корелюється тривалістю сонячного випромінювання, сонячним УФ-індексом та типом ґрунту. Для українських зразків відмічене збільшення вмісту кроцину та пікрокроцину у шафрані з північно-східних регіонів України та зменшення ближче до південно-західних районів вирощування, але врожайність сировини протилежна. Вперше розроблено метод ГХ-МС для одночасного визначення у рослинні сировині амінокислот, карбонових кислот, а для шафрану – маркерної сполуки – шафраналю (вміст від 50,87 до 77,59%). Серед компонентів шафрану, домінуючими були α-ліноленова, ліноелаїдинова кислота, L-тирозин.
Запропоновано методики ВЕРХ та ВЕТШХ для виявлення можливих фальсифікацій шафрану та подальшої стандартизації сировини. Кроцин, пікрокроцин, у протестованих фальсифікатів (куркума, сафлор, нагідки,
чорнобривці, жовті тичинки тюльпану) не виявлено. Дані ВЕТШХ корелювали з даними аналізу ВЕРХ, де характерні піки кроцину (UV λ max 261, 440, 466 нм) були відсутні у фальсифікатів. Розроблена методика ВЕРХ для визначення колхіцину в сировині к. посівного дозволила підтвердили відсутність алкалоїду у сировині та вирішити питання про можливу фальсифікацію та токсичність шафрану. Вперше було розроблено стандартну операційну процедуру одержання робочих стандартів пікрокроцину та кроцинів (t-4GG, t-2G, t-3Gg) методом препаративної хроматографії за допомогою колонки Symmetry Prep C18 (300×19 мм×7 мкм) для рутинного контролю якості шафрану. За результатами експериментальних досліджень розроблено та впроваджено монографію «Шафрану посівного приймочки N » (ДФУ 2.4). Серед досліджених видів фармакологічних активностей, цитотоксична дія на лінії гліобластоми була найбільш вираженою для сухого водного екстракту шафрану, а спиртовий – значно знижував життєздатність меланоми та потрійно негативного раку молочної залози. Дослідженнями хімічного складу побічних продуктів виробництва шафрану встановлено вміст фенольних сполук, амінокислот, карбонових кислот, макро- і мікроелементів. Окремо вивчено хімічний склад листя восьми видів і сортів крокусів, серед яких найбільш перспективним виявився крокус гарний (Crocus spеcious), та п’ять зразків квітів різних сортів крокусів. Вперше проведено виділення 16 індивідуальних речовин з оцвітини к. посівного методом колонкової хроматографії, серед них софорофлавонолозид, космосіїн, текторидин, нігрицин, іристекторигенін В, мангіферин, рутин, ферулова кислоти виділено вперше, крім того виділено раніше описані для к. посівного кверцетин, хлорогенову, неохлорогенову кислоти, астрагалін, кемпферол, ізоорієнтин, ізорамнетин, ізокверцитрин. Структури речовин встановлювали методами ЯМР-спектроскопії. Сухі екстракти бульбоцибулин крокусу проявили значну протиалергійну, противірусну (H1N1,30-40% захист), цитотоксичну дію по відношенню до клітин раку нейробластоми (ЕС 50 0,018 мг/мл) та гліобластоми U-87 (ЕС 50 0,02 мг/мл), особливо полісахаридний комплекс (IGR39, EC 50 0,2 мг/мл). Екстракти
листя та оцвітини крокусу проявили виражений антиоксидантний ефект. Всі одержані екстракти належать до V класу токсичності за класифікацією К. К. Сидорова. Дослідження in vivo підтвердили виражену протизапальну дію екстрактів бульбоцибулин. Розроблено параметри стандартизації для сировини та екстрактів. Модифіковано ВЕРХ-ДМД методику аналізу фенольних сполук ірисів, яку було апробовано на кореневищах і. блідого, і. угорського, і. сибірського, і. строкатого, що дозволила ідентифікувати та встановити вміст 25 фенольних сполук у всіх дослідних зразках ірисів. Домінуючими речовинами були мангіферин, 5,6-дигідрокси-7,8,3’,5’-тетраметоксиізофлавон, текторидин, германаїзм В, іристекторигенін B, іригенін. Дослідження впливу факторів навколишнього середовища на вміст фенольних сполук у кореневищі та листі і.
германського, і. болотного, і. сибірського, і. солелюбивого з 16 популяцій України, Литви та Латвії. Встановлено, що на накопичення фенольних сполук у ірисів позитивний вплив мають тривалість сонячного випромінювання та вміст фосфору у ґрунті. Досліджено склад карбонових кислот для кореневищ та листя I.
graminea, I. sibirica, I. halophila, I. pallida, I. variegata, I. pumila, I. musulmanica, I. carthaliniae, I. medwedewii. Вміст насичених жирних кислот у кореневищах видів ірисів переважає (від 15% до 53%), а в листі переважає
вміст ненасичених (зокрема полієнових) кислот. Серед органічних кислот домінантними є лимонна, яблучна, щавлева кислоти. Проведено дослідження терпеноїдів кореневищ та листя 27 видів та сортів рослин роду Ірис. Загальний вихід ефірної олії кореневищ ірисів становить від 0,02% до 0,58%. Домінуючою сполукою є α-ірон (до 2,85 %). Вперше виявлені нортерпеноїди та їх похідні: β-дамаскенон, β-іонон-5,6-епоксид, β-іонон у видах ірисів. Встановлено переспективність кореневищ у малодосліджених ірисів (I. мusulmanica, I. virginica, I. notha, I. halophila, I. hybrida Stocholm інші) у якості ефіроолійної сировини за рахунок високого вмісту маркерних речовин ефірної олії (β-іонон, α-ірон, транс-2,6-γ-ірон). Проведено дослідження фармакологічної активності для сухих водних та спиртових (70%) екстрактів з кореневищ та листя видів ірисів. Найбільш
виражену антибактеріальну дію виявив спиртовий екстракт листя і. сибірського, протиалергійну та протиентеровірусну дію – водний екстракт кореневищ і. строкатого, а цитотоксичну, протигрипозну та протиентеровірусну дію проявили екстракти кореневищ ірису угорського. Оцінено противірусний потенціал індивідуальних сполук ірису, для цього було вдосконалено методику виділення сполук з кореневищ і. угорського методом колонкової хроматографії, що дозволило додатково виділити 12 сполук, серед них
вперше: кікалідон, ірисолідон, іристекторин В, іристекторигенін В, 5,6- дигідрокси-7,8,3’,5’ тетраметоксиізофлавон, германаїзм B, ірилон, апігенін-7- глюкозид, ізокверцитрин, кемпферол, корична та кумарова кислоти. Крім того виділено: нігрицин, іригенін, ононін, геністеїн, дайдзеїн, формононетин,
мангіферин, ізомангіферин, текторигенін, текторидин, гіперозид, апігенін, кверцетин, ембінин, хлорогенову, неохлорогенову, кофейну, ферулову кислоти. Структуру сполук встановлювали за допомогою 1D та 2D ЯМР-
спектроскопії. Методом ChemGPS-NP встановлено, що найбільш прогностичними протиентеровірусними (D68) фенольними сполуками можуть бути ірисолідон, кікалідон, кемпферол, а протигрипозними (H1N1) – апігенін, кверцетин, кемпферол, що підтвержено дослідженнями in vitro (ірисолідон 1,95%
інгібування при 50 мкМ, IC 50 9,2 мкМ), кікалідон 5,93%, кемпферол 14,83%, апігенін 100% при 50 мкМ, кемпферол 92%, кверцетин 48%) та аналізом інгібування нейрамінідази. За допомогою системи ранжування хімічних маркерів рослин, даних фармакогностичного аналізу та фармакологічного скринінгу речовин та
екстрактів було обґрунтовано вибір Q-маркерів для сировини та екстрактів к. посівного та рослин роду Ірис, а саме для шафрану: кроцин, пікрокроцин, шафраналь, рутин, апігенін, для його побічних продуктів виробництва – кроцин, рутин, ізокверцитрин, ізоорієнтин, кемпферол, кверцетин, ферулову кислоту, мангіферин, L-пролін, L-піроглютамінова кислота на основі їх використання для лікування різних ліній ракових клітин; для видів ірисів: ірисолідон, іригенін, текторидин, кемпферол, кверцетин, апігенін,
мангіферин, хлорогенова кислота та α-ірон з урахуванням їх протиракового та противірусного потенціалу.
Для к. посівного, і. угорського та двох сортів ірисів («Indian Pow Wоw» та «Galleon Gold») розроблені стандартні операційні процедури щодо належного культивування лікарських рослин відповідно до керівних
принципів Належної практики культивування та збирання вихідної ЛРС, обробки рослинної сировини, контроль якості сировини для фармацевтичної галузі. Застосування екологічних стрес-методів (холодна плазма, вакуум, електромагнітне поле) передпосівної обробки посівного матеріалу к. посівного, дозволила ідентифікувати та кількісно визначити вміст 23 естерів кроцетину, рутин, пікрокроцин та шафраналь, при цьому електромагнітне поле мало найбільший вплив біосинтез речовин-маркерів: збільшення вмісту
кроцину t-4GG у 4 рази, а шафраналю та пікрокроцину – у 2 рази. Крім того, обрані стрес-методи мали позитивний вплив на загальний кількісний вміст фенольних сполук та вільну радикальну активність у оцвітині та листі крокусу. Застосування монокомпонентного живлення хелатом заліза (Fe 2+ ), хелатом калію (К + ) та сульфатом магнію (Mg 2+ ) сортових ірисів («Цікавинка», «Талібо», «Widcombe Fire») показало динаміку стабільного вмісту фенольних речовин, крім того відмічене значне вмісту речовин-маркерів геністину (до 9,67 мг/г), іригеніну (до 3,52 мг/г) та ірисолідону у кореневищах, а хлорогенової кислоти та мангіферину – у листі ірисів. Визначення оптимальних термінів заготівлі сировини ірисів з 16 популяцій України, Литви, Латвії, показало, що вміст фенольних сполук залежності від вегетаційного періоду і має максимальне накопичення влітку. За результатами досліджень отримано патенти на винахід «Спосіб одержання засобу з протираковою, антиоксидантною та антибактеріальною активністю з оцвітини крокусу посівного» № 124210 від 04.08.2021 та на корисну модель «Спосіб культивування, збирання та зберігання шафрану» № 135685 від 10.07.2019, «Спосіб одержання засобу з протираковою, антиоксидантною та антибактеріальною активністю з листя крокусу посівного» № 146567 від 03.03.2021; подано заявку на патент Європейського Союзу LT2021 527, 106245, від 03.06.2021 на спосіб одержання полісахаридного комплексу з бульбоцибулин к. посівного з цитотоксичною дією, а у роботу фермерських господарств впроваджено «Стратегії вирощування шафрану в Україні. Методичні рекомендації з оптимізації технології вирощування та збору шафрану (Crocus sativus) в різних ґрунтово- кліматичних зонах України» (2019).
Ключові слова: крокус посівний, види ірисів, сорти ірисів, фармакогностичне дослідження, належна практика вирощування лікарських рослин, виділення БАР, стандартизація, віртуальний скринінг,
фармакологічна активність.