Пошук та вивчення речовин з анальгетичною, протизапальною та фригопротекторною дією серед нових похідних 5,7-діацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]триазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазину

Коваль А.Я. Пошук та вивчення речовин з анальгетичною, протизапальною та фригопротекторною дією серед нових похідних 5,7-діацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]триазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазину. – Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.

Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії за спеціальністю 222 – Медицина (22 – Охорона здоров’я). – Державне некомерційне підприємство "Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького" МОЗ України, Львів, 2025.

Дисертаційна робота присвячена пошуку та вивченню перспективних речовин з анальгетичною, протизапальною та фригопротекторною дією серед нових похідних 5,7-діацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]триазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазину, виявленню сполуки-лідера, конкурентоспроможної із сучасними аналогами на предмет придатності для створення нового лікарського засобу.

В роботі вперше зроблено віртуальний прогноз спектру фармакологічної дії 23 нових біологічно активних сполук похідних 5,7-діацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]триазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазину, що дозволило передбачити ймовірність наявності знеболювальної та/чи протизапальної активності у досліджуваних сполук та стало підставою для експериментальної верифікації даних.

Вперше проведено первинний фармакологічний скринінг 23 нових біологічно активних сполук похідних 5,7-діацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]триазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазину та встановлено, що більшість досліджуваних речовин виявили виразний антиноцицептивний ефект на моделях термічної («гаряча пластина») та хімічної (оцтовокислі «корчі») ноцицептивної стимуляції, який реалізується як на центральному, так і на периферичному рівні. Показано, що окремі сполуки в експерименті виявляли аналгетичну активність, що була близька до такої кеторолаку чи переважала його.

Отримано нові дані щодо протизапальної дії досліджуваних сполук на моделі карагенінового набряку, котрі засвідчили, що більшість з них виявляють суттєвий ефект, який наближається до дії препарату порівняння диклофенаку натрію.

Згідно з результатами молекулярного докінгу встановлено, що досліджувані сполуки потенційно виявляють протизапальний вплив переважно через вплив на 5-ліпоксигеназо активуючий протеїн та меншою мірою на 5-ліпоксигеназу. Вплив на циклооксигеназу-1 та циклооксигеназу-2 є меншим у порівнянні з референтними лікарськими засобами, однак ця взаємодія може збільшувати сумарний протизапальний ефект досліджуваних речовин.

Подальші дослідження передбачали вивчення гострої токсичності та цитотоксичності найбільш активних сполук з вираженою антиноцицептивною дією (IFT_180, IFT_247, IFT_251, IFT_252, IFT_257), оскільки це є ключові етапи доклінічного дослідження потенційних лікарських засобів. Вони необхідні для визначення безпечного діапазону доз, оцінки можливих ризиків для здоров’я, а також для прийняття рішення щодо подальших тестів in vivo і клінічних випробувань.

Гостру токсичність зазначених сполук визначали за одноразового в/ш введеня. На підставі отриманих результатів розраховано ЛД₅₀, яка для досліджуваних сполук коливається в діапазоні від 2840±340 мг/кг до 4500±350 мг/кг. Таким чином, усі досліджувані сполуки належать до IV класу токсичності (500 мг/кг < ЛД₅₀ < 5000 мг/кг) за класифікацією Нoge та Sterner, тобто є малотоксичними.

Аналіз результатів цитотоксичності сполук на псевдонормальні клітини засвідчили, що токсичність досліджуваних сполук знижувалася в такому порядку: IFT_180 > IFT_247 > IFT_251 > IFT_252 > IFT_257 для трансформованих клітин нирки ембріона людини лінії HEK293T, тобто IFT_180 була більш токсичною, ніж IFT_257. Для макрофагів миші лінії J774.2 токсичність досліджуваних сполук знижувалася в такому порядку: IFT_180 > IFT_247 > IFT_252 > IFT_257 > IFT_251.

Таким чином, невисокі токсикометричні параметри досліджуваних сполук є одним із аргументів розглядати їх як потенційно безпечні та обрати їх для подальшого поглибленого доклінічного вивчення.

Скринінгові дослідження найактивніших сполук на фригопротекторні властивості на моделі гострого загального охолодження засвідчили, що така активність не є загальною ознакою сполук цього ряду. Так, сполука IFT-180 не вплинула на час життя мишей за холодової експозиції, тобто вона на має фригопротекторних властивостей. Потужні фригопротекторні властивості виявила сполука IFT_247, що статистично значуще збільшила тривалість життя щодо контролю на 43,6% (p<0,01), не поступаючись референс-препарату диклофенаку натрію, що збільшив час виживання мишей на 50,9% (p<0,01).

За результатами проведених досліджень для подальшого поглибленого вивчення визначено сполуку-лідера – IFT_247. За результатами оцінки дозозалежності знеболювального ефекту сполуки IFT_247 встановлено, що найменша з випробуваних доз 5 мг/кг спричинила слабкий знеболювальний ефект на рівні тенденції (приріст 34,9%). Збільшення дози до 15 мг/кг спричинило більший ефект (приріст 68,1%, p<0,01). Ефект дози 25 мг був найбільшим (приріст 149,6%, p<0,001), а підвищення дози до 35 мг/кг не посилювало його (приріст 135,9%, p<0,001). Отже, аналгетична дія сполуки IFT_247 залежить від дози, а максимальною ефективною можна вважати дозу 25 мг/кг, і саме її взято для наступних експериментів.

Аналіз результатів вивчення опіоїдергічного механізму сполуки IFT_247 демонструє, що блокатор опіоїдних рецепторів налоксон не вплинув на її знеболювальний ефект. У тесті «Гаряча пластина» ця сполука per se збільшила латентний період облизування задньої лапи в середньому на 54%. На тлі дії налоксону латентний період ноцицептивної реакції зріс на 72,8%, відмінності з показником групи досліджуваної сполуки per se відрізняються на рівні тенденції. Для порівняння аналогічний експеримент виконано з класичним анальгетиком-антипіретиком метамізолом натрію. Середній приріст латентного періоду ноцицептивної реакції за його використання per se становив 306,3%, а за попередньої блокади опіоїдних рецепторів налоксоном – 204,4%, тобто зменшувався в середньому на третину, а медіана фінального латентного часу зменшилася в 2 рази при майже однаковому вихідному значенні. Отже, опіоїдергічний механізм, очевидно, не бере участі в аналгетичній дії сполуки IFT_247.

Для виявлення небажаних ефектів на центральну нервову систему або змін у поведінці використано тест "відкрите поле", який засвідчив відсутність суттєвого впливу сполуки IFT_247 на поведінку мишей. Єдиною значущою відмінністю було збільшення кількості болюсів (p<0,05), проте решта показників емоційних реакцій та їх вегетативного супроводу (грумінг, уринації) не відрізнялися від контрольних значень. Таким чином, досліджувана сполука (IFT_247) не спричиняє ані стимулювального, ані пригнічувального впливу на центральну нервову систему.

Сполука IFT_247 у дозі 18 мг/кг у щурів за в/ш введеня виявляє виразну фригопротекторну активність та на рівні диклофенаку натрію – збільшує час життя мишей за гострого запального охолодження. Так, у найгострішому періоді холодової травми в щурів досліджувана сполука запобігає розвитку синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові у та тромбозу, зменшуючи вміст D-димеру та фібриногену в сироватці крові та нормалізуючи підвищений тромбіновий час. Також встановлено, що IFT_247 пригнічує розвиток системної запальної реакції: запобігає збільшенню вмісту лейкотриєнів В4 та тотальних (це підтверджує результати молекулярного докінгу щодо можливості впливу на 5-ліпоксигеназо активуючий протеїн та 5-ліпоксигеназу), поступаючись за цією властивістю диклофенаку натрію; подібно до диклофенаку натрію значно зменшує до субнормального рівня рівень інтерлейкіну 1β та до нормального – фактора некрозу пухлин α без впливу на інтерлейкін 6 та на зменшений вміст протизапальних цитокінів – інтерлейкінів 4 та 10, нормалізує збільшене співвідношення про- та протизапальних цитокінів.

За холодової травми рівень синтази оксиду азоту у печінці в щурів групи контрольної патології зменшується в 1,5 разу щодо інтактного контролю, що вказує на зменшення продукції оксиду азоту та може віддзеркалювати адаптивну реакцію на загальне охолодження – вазоконстрикцію задля зменшення втрат тепла. Під впливом диклофенаку натрію та сполуки IFT_247 рівень синтази оксиду азоту залишається на рівні інтактного контролю.

Ці результати доповнюють фармакологічну характеристику досліджуваного представника 5,7-діацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]тріазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазинів як потенційного неопіоїдного анальгетика та фригопротекторного засобу, меншою мірою протизапального засобу, та обґрунтовують доцільність подальшого поглибленого вивчення сполуки 1-(5-ацетил-3-метил-6-феніл-5H-[1,2,4]тріазоло[3,4-b][1,3,4]тіадіазин-7-іл)-етанону (IFT-247), що може стати основою для створення нового вітчизняного лікарського препарату.

За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт.

 

Ключові слова: похідні 5,7-диацил-3-H(алкіл)-6-арил-5Н-[1,2,4]триазол[3,4-b][1,3,4]тіадіазинів; біологічна активність; аналгетична дія; протизапальна дія; фригопротекторна дія; дозозалежність; механізм дії; гостра токсичність; цитотоксичність; холодова травма; цитокіни; інтерлейкіни; система гемостазу; віртуальний скринінг; молекулярний докінг.

 

ABSTRACT

Koval A. Ya. Search and study of substances with analgesic, anti-inflammatory and frigoprotective action among new derivatives of 5,7-diacyl-3-H(alkyl)-6-aryl-5H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazine. – Qualification scientific work in the form of a manuscript.

Dissertation to obtain the degree of Doctor of Philosophy, specialty 222 – Medicine (22 – Healthcare). – State non-profit enterprise «Danylo Halytsky National Medical University in Lviv» Ministry of Health of Ukraine, Lviv, 2025.

The dissertation is devoted to the search for and study of promising substances with analgesic, anti-inflammatory, and cryoprotective effects among new derivatives of 5,7-diacyl-3-H(alkyl)-6-aryl-5H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazine, and to the identification of a lead compound competitive with current analogs for the potential development of a new medicinal product.

For the first time, a virtual prediction of the pharmacological activity spectrum of 23 new biologically active derivatives of 5,7-diacyl-3-H(alkyl)-6-aryl-5H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazine was carried out, which allowed forecasting the likelihood of analgesic and/or anti-inflammatory activity of the studied compounds and served as the basis for experimental verification.

A primary pharmacological screening of 23 new biologically active derivatives of this chemical class was performed for the first time. It was established that most compounds exhibited a pronounced antinociceptive effect in models of thermal ("hot plate") and chemical (acetic acid-induced "writhing") nociceptive stimulation, indicating both central and peripheral mechanisms of action. Some compounds demonstrated analgesic activity comparable to or exceeding that of ketorolac.

New data were obtained on the anti-inflammatory activity of the compounds using the carrageenan-induced paw edema model, indicating that most of them exhibit significant effects approaching those of the reference drug diclofenac sodium.

Molecular docking results revealed that the studied compounds exert potential anti-inflammatory effects mainly by targeting the 5-lipoxygenase-activating protein, and to a lesser extent, 5-lipoxygenase. The effects on Cyclooxygenase-1 and Cyclooxygenase-2 were weaker than those of reference drugs but may contribute to the overall anti-inflammatory activity.

Further studies included the evaluation of acute toxicity and cytotoxicity of the most active compounds (IFT_180, IFT_247, IFT_251, IFT_252, IFT_257) with pronounced antinociceptive activity, as these are crucial stages of preclinical drug research. They help determine the safe dose range, assess health risks, and support decisions for further in vivo testing and clinical trials.

The compounds' acute toxicity was determined via a single intragastric administration. The calculated LD₅₀ ranged from 2840±340 mg/kg to 4500±350 mg/kg, classifying all tested compounds as low-toxic (toxicity class IV, according to Hodge and Sterner classification).

Cytotoxicity analysis on pseudo-normal cells showed the following toxicity ranking for human embryonic kidney HEK293T cells: IFT_180 > IFT_247 > IFT_251 > IFT_252 > IFT_257. For murine macrophages (J774.2), the order was: IFT_180 > IFT_247 > IFT_252 > IFT_257 > IFT_251. IFT_257 was the least toxic compound.

Cryoprotective screening using a model of acute generalized hypothermia showed that this property is not inherent to all compounds in the series. For instance, IFT_180 did not prolong survival under cold exposure, while IFT_247 significantly increased survival time by 43.6% (p<0.01), comparable to diclofenac sodium (50.9%, p<0.01).

Based on the results, IFT_247 was identified as the lead compound for further detailed study. Dose-dependence of the analgesic effect of IFT_247 was established: the lowest tested dose of 5 mg/kg induced a slight effect (34.9% increase), 15 mg/kg showed greater activity (68.1%, p<0.01), and 25 mg/kg resulted in the strongest effect (149.6%, p<0.001), which did not increase further at 35 mg/kg.

Investigation of the opioid mechanism of IFT_247 showed that naloxone did not alter its analgesic effect, indicating a non-opioid mechanism. In the "hot plate" test, IFT_247 increased the latency to paw licking by 54%, and this effect persisted under naloxone pretreatment.

For comparison, metamizole sodium increased latency by 306.3% alone and by 204.4% with naloxone, suggesting partial involvement of the opioid system. Therefore, IFT_247 likely acts via a non-opioid mechanism.

An "open field" test found no significant behavioral changes in mice after IFT_247 administration, except for an increased number of fecal boli (p<0.05), with no impact on other indicators of emotional or autonomic reactions.

At 18 mg/kg orally, IFT_247 exhibited strong cryoprotective activity in rats, similar to diclofenac sodium, improving survival under acute inflammatory hypothermia. It prevented disseminated intravascular coagulation syndrome and thrombosis, reduced serum D-dimer and fibrinogen levels, and normalized prolonged thrombin time.

IFT_247 also suppressed systemic inflammation by reducing leukotriene B4 and total leukotriene levels (supporting the predicted 5-lipoxygenase-activating protein and 5-lipoxygenase targets), and lowered Interleukin-1 -1β and Tumor necrosis factor levels to normal ranges. It had no significant effect on Interleukin-6, Interleukin-4, or Interleukin-10, but normalized the pro-/anti-inflammatory cytokine ratio.

Cold injury reduced hepatic nitric oxide synthase levels by 1.5 times versus controls, indicating decreased nitric oxide production and possible vasoconstriction. Treatment with diclofenac sodium or IFT_247 restored nitric oxide synthase levels to normal.

These findings characterize the studied 5,7-diacyl-3-H(alkyl)-6-aryl-5H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazine derivative as a potential non-opioid analgesic and cryoprotective agent with moderate anti-inflammatory properties. The results justify further in-depth study of 1-(5-acetyl-3-methyl-6-phenyl-5H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazin-7-yl)ethanone (IFT-247) as a candidate for a novel domestic pharmaceutical product.

Based on the dissertation, 15 scientific papers have been published.

 

Key words: derivatives of 5,7-diacyl-3-H(alkyl)-6-aryl-5H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazines; biological activity; analgesic activity; anti-inflammatory activity; cryoprotective activity; dose dependence; mechanism of action; acute toxicity; cytotoxicity; cold injury; cytokines; interleukins; hemostasis system; virtual screening; molecular docking.

 

https://drive.google.com/file/d/1n3AoWB7vuOKx0vXYVWhRte0OnJGQrBqD/view?usp=sharing