Характеристика біологічних властивостей лактобацил за взаємодії з автохтонною і патогенною мікробіотою in vivo та in vitro.

Лаврик Г. С. Характеристика біологічних властивостей лактобацил за взаємодії з автохтонною і патогенною мікробіотою in vivo та in vitro. -
Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук (доктора філософії) за спеціальністю 03.00.07 «Мікробіологія». - Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Львів, 2020;
Одеський національний університет імені І. І. Мечникова, Одеса, 2020.
У дисертації викладено результати порівняльного дослідження біологічних властивостей індигенних лактобацил і встановлення характеру їхньої взаємодії із пробіотичними штамами та іншими мікроорганізмами. Відповідно до даних наукової літератури відомо, що формування Lactobacillus spp. приепітеліальних мікробіоценозних біоплівок створює потужний біологічний барєр, який попереджає колонізацію епітелію патогенними мікроорганізмами і забезпечує збереження власної мікробіоти у
природних біотопах організму людини. Особливу увагу привертають і умовно-патогенні бактерії, які, формуючи біоплівкову структуру, спричиняють запальні процеси, що важко піддаються лікуванню. Серед них стафілокок є основною причиною розвитку персистуючих хронічних гнійно-запальних інфекцій.
Для підвищення ефективності протимікробної терапії гнійно-запальних процесів, спричинених стафілококами, продовжується пошук засобів, які б дали змогу дезінтегрувати біоплівку для переведення патогена у планктонну форму.
Антибактеріальна активність лактобацил зумовлена продукцією метаболітів, які можуть бути ефективними антагоністами проти біоплівкових форм патогенів.
Результати останніх досліджень диктують необхідність розробки нових принципів клінічного застосування живих мікроорганізмів для мінімального ризику побічних ефектів та підвищення ефективності корекції мікробіоти травного, вагінального трактів та ротоглотки пробіотиками з врахуванням взаємовідносин пробіотичних культур з індигенними лактобацилами людини.

У дисертаційній роботі вивчено видовий спектр лактобацилярної мікробіоти природних екосистем людського організму. Встановлено, що лактобацили виділяються у різних відсоткових частках у залежності від
природної екосистеми: найбільший відсоток з ротоглотки (81,1 %), 62,5 % - з травного тракту і найменшу кількість - 45 % з вагіни. Встановлено домінування у всіх екологічних нішах виду L. acidophilus (30,3 %). Видовий спектр усіх біотопів включав L. acidophilus, L. fermentum, L. casei, L. plantarum і L. rhamnosus, лише L. helveticus (6,9 %) та L. gasseri (4,2 %) висівалися з вагінального тракту. У всіх екосистемах переважали гетероферментативні лактобацили. Зафіксовано дисоціацію штаму L. rhamnosus за морфологічними,
культуральними та біохімічними властивостями за умов дисбіотичних змін.
Встановлено, що пробіотичні штами L. рlantarum Р17630, L. аcidophilus КS 400, L. рlantarum 8R-A3 спричиняють виражене пригнічення росту умовно-патогенних мікроорганізмів. L. рlantarum 8R-A3 проявив найвищу антагоністичну активність відносно грамнегативних бактерій клінічних ізолятів
E. coli та P. aeruginosa. Найвищу протигрибкову активність встановлено для L. plantarum Р17630.
Лактобацили, виділені від практично здорових жінок, проявляють деяку антагоністичну активність лише відносно С. albicans, проте є неактивними у жінок з проявами вульвовагінального кандидозу. Відносно видів C. non–аlbicans антагонізму не виявлено.
Виявлено найвищі показники адгезивності до клітин людського організму для L. acidophilus ротоглотки (4,12±0,07) та вагіни L. plantarum (4,36±0,22). Найвищий показник адгезії для ізолятів травного тракту
встановлено для виду L. casei (4,66±0,04) відносно клітин букального епітелію.
Індекс адгезивності лактобацил до людських еритроцитів І (0) групи крові є значно нижчим, ніж до букального епітелію.
Встановлено відмінності чутливості до протимікробних препаратів культур лактобацил, виділених з різних екосистем людського організму. Ротоглотковим ізолятам лактобацил властива чутливість до протимікробних
препаратів, яка характерна більшою мірою для грампозитивної мікробіоти, що заселяє зів, а частина кишкових ізолятів чутлива до препаратів (аміноглікозиди, тетрацикліни), які є активними, зазвичай, для представників ентеробактерій, що може бути непрямим свідченням міжвидового обміну генетичним матеріалом серед представників однієї екологічної ніші. Відмічено більш високі показники
чутливості до фторхінолонів кишкових ізолятів лактобацил, порівняно із ротоглотковими. У 5,4% лактобацил встановлено чутливість до протигрибкових препаратів, зокрема клотримазолу. У досліді in vivo за умов антибіотикоасоційованого дисбактеріозу відновлення вихідних значень лактобацил та біфідобактерій у складі
мікробіоценозу кишечника було досягнуто лише у відновний період серед мишей, яким не згодовували біопрепарати (спонтанне відновлення) та за умов використання аутоштамів лактобацил. Процес відновлення нормобіоценозу серед тварин обох груп практично не відрізнявся. Використання для корекції мікробіоти пробіотичних штамів, а також згодовування суміші індигенних та пробіотичних штамів було недостатнім для досягнення кількісного рівня Lactobacіllus spp. та Bifidobacterium spp. вихідних значень. За допомогою інтерференційної (диференційно-інтерференційний контраст - DIC) мікроскопії з використанням конденсора темного поля та флуоресцентної мікроскопії вперше досліджено здатність пробіотичного штаму
L. рlantarum 8R-A3 (48-годинної монокультури) в умовах in vitro формувати біоплівку значної щільності - 1,79±0,04 од. Встановлено, що співвідношення клітин у зеленій/червоній ділянці спектру (життєздатних клітин до мертвих) становить 78/22 %, що забезпечує швидку колонізацію слизових оболонок організму людини, і зупиняє розвиток патологічного процесу, спричиненого стафілококами. У змішаній культурі молочнокислі бактерії здатні індукувати загибель біоплівкоутворювальних стафілококів, що показано при моделюванні
біоплівки стафілококами, виділеними із гною пустул хворих на acne vulgaris.
Визначальним фактором у клінічному перебігу вугрової хвороби є саме здатність бактерій до плівкоутворення. За допомогою електронної мікроскопії виявлено незворотні ультраструктурні зміни біоплівкоутворювальних стафілококів під впливом пробіотичних штамів лактобацил, а у змішаних культурах з індигенними ізолятами лактобацил стафілококи набували здатності переходити у стан спокою. Вперше доведено, що у змішаній культурі молочнокислі бактерії здатні індукувати загибель стафілококів, які перебувають у біоплівковій формі, не переводячи її у планктонну.
Для підтвердження отриманих результатів (люмінесцентна та електронна мікроскопії) проводили контрольні посіви з біоплівок змішаних культур на поживне середовище, що дало змогу отримати ріст лактобацил
(пробіотичних та індигенних ізолятів) на глюкозному агарі (1%) за аеробних умов.
Окрім спектрофотометричних, електронно- та флуоресцентно- мікроскопічних методів дослідження здатності до біоплівкоутворення, була використана полімеразна ланцюгова реакція для виявлення відповідних генів у
стафілококів. Серед 27 ізолятів S. аureus нами виявлено наявність генів icaA у 35,71 % штамів, а ген icaD – 53,57 %. При вивченні метаболічних факторів антагоністичної активності лактобацил встановлено індукцію інгібуючої дії нативних культур лактобацил на початку стаціонарної фази їхнього росту. Фільтрування надосадової рідини лактобацил призвело до різкого зниження їхньої активності, а при нейтралізації цієї рідини 2 н NaOH та каталазою не зафіксовано інгібування біоплівкоутворювальних стафілококів, що може бути свідченням прояву антагоністичних властивостей лише за функціональної активності живих клітин
лактобацил. Доповнено новими даними уявлення щодо видового спектра бактерій роду Lactobacillus, виділених з різних екосистем людського організму, їхньої біологічної активності та антибіотикочутливості.
Зафіксовано дисоціацію за морфологічними та культуральними властивостями у культурах L. rhamnosus, що виділялися від осіб з ознаками дисбіотичних порушень, що супроводжувалась також незначною альтерацією
біохімічних властивостей (ферментація арабінози та незброджування мелецитози). Вперше запропоновано використання для культивування і зберігання бактерій роду Lactobacillus spp. поживне середовище на основі ячмінного солоду.
Вперше встановлено взаємозв’язок між чутливістю до протимікробних препаратів ізолятів лактобацил та мікробіотою відповідно до ніш, які вони заселяють. За умов антибіотико-асоційованого дисбактеріозу за результатами експериментального дослідження доведено більш високу ефективність застосування біокорегуючих препаратів для відновлення лактобацилярної мікробіоти в порівнянні з використанням аутоштамів лактобацил. Вперше встановлено здатність пробіотичного штаму L. рlantarum 8R-A3
в умовах in vitro до біоплівкоутворення, а також показано набуття здатності лактобацил (пробіотичних та індигенних ізолятів) до росту на глюкозному агарі (1%) за аеробних умов після виділення їх у змішаних культурах з біоплівкоутворювальними стафілококами. Вперше показано зміни ультраструктури стафілококів, спричинені активністю пробіотичних штамів лактобацил, і доведено їх незворотність. Натомість індигенні лактобацили здатні лише індукувати перехід стафілококів у стан спокою. Доведено, що антагоністична активність лактобацил індукується біоплівкоутворювальними стафілококами. Для лікування та профілактики інфекційних запальних процесів різної локалізації рекомендується включати пробіотичні препарати лактобацил (лактобактерин, гінофлор, гінолакт) у відповідності до їхнього видового складу, призначення та у залежності від їхньої протимікробної активності. Так, для лікування гнійно-запальних процесів, які спричиняються S. aureus та P. aeruginosa, можуть бути рекомендовані препарати, які містять L. рlantarum
8R-A3. Високо ефективною при лікування ешерихіозів та патогенних процесів є L. рlantarum 8R-A3. Для лікування вульвовагінальних кандидозів, спричинених C. ablicans та C. non-аlbicans рекомендовано препарати, які містять L. рlantarum Р17630. У патогенезі acne vulgaris слід враховувати дисбіотичні порушення у інших екосистемах організму людини. З метою підвищення ефекту лікування acne vulgaris застосовувати як комбінування протимікробних хіміотерапевтичних препаратів з біопрепаратами лактобацил, так і комплексне
лікування – внутрішнє застосування еубіотиків із засобами місцевої біотерапії.